Emulsiones agua en aceite: Un nuevo sistema para el ensamblaje de las proteínas de unión de clorofila-solubles en agua con pigmentos hidrófobos

pigmentos hidrófobos tales como las clorofilas (Chls), bacterioclorofilas (Bchls) y los carotenoides son los cofactores primarios en los centros de reacción fotosintéticos y proteínas de recolección de luz que llevan a cabo el transporte de electrones, y la captura de energía de la luz y la transferencia. Los centros de reacción y la mayor parte de los complejos de recolección de luz Chl-de unión son proteínas transmembrana. La proteína Fenna-Matthews-Olson (FMO) de la bacteria fotosintética verde-azufre no oxigénica ^1,2, y la proteína peridinina-Chl (PCP) de dinoflagelados ³ son ejemplos excepcionales de proteínas solubles en agua captadores de luz. La unión de clorofila proteínas solubles en agua (WSCPs) de Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae y plantas Amaranthaceae ^{4, 5} son otro ejemplo único, sin embargo, en contraste con FMO y el PCP, éstos no son ni involucrarse en recolección de luz ni en ninguna de la reacción fotosintética primaria y su grafía precisasiological funciones todavía no están claros ^5-8. Su alta afinidad de unión a Chl han dado lugar a una función sugerido como portadores transitorios de Chls y derivados de Chl ^9,10. Alternativamente, se planteó la hipótesis de que PCSW juega un papel en los basureros Chls en las células dañadas y protege contra el daño foto-oxidativa inducida por Chl ^7,11-13. Más recientemente, se sugirió que las funciones PCSW como un inhibidor de la proteasa y desempeña un papel en la resistencia herbívoro, así regula la muerte celular durante el desarrollo de la flor ^14. WSCPs se dividen en dos clases principales de acuerdo con sus propiedades fotofísicas. La primera clase (clase I, por ejemplo. De Chenopodium album) puede someterse a fotoconversión tras la iluminación. WSCPs Clase II de las plantas del género Brassica, que no sean objeto de fotoconversión ^5,10, se subdividen en la clase IIa (por ejemplo., De Brassica oleracea, Raphanus sativus) y IIb (por ejemplo., De Lepidium virginicum </em>). La estructura de clase IIb PCSW de Lepidium virginicum fue resuelto por cristalografía de rayos X a una resolución de 2,0 Å ^8. Revela un homotetrámero simétrica en la que las subunidades de la proteína forman un núcleo hidrófobo. Cada subunidad se une una sola Chl que se traduce en una disposición apretada de cuatro Chls estrechamente empaquetados dentro de los core.This sencilla todo disposición Chl hace WSCPs un sistema modelo potencialmente útil para el estudio de unión y ensamblaje de complejos Chl-proteína, y los efectos de la vecina Chls y entornos de proteínas en las propiedades espectrales y electrónicas de Chls individuales. Además, se puede proporcionar plantillas para la construcción de proteínas de unión a Chl artificiales que pueden ser utilizados para los módulos de captación de luz en dispositivos fotosintéticos artificiales.

Estudios rigurosos de WSCPs nativos no son factibles debido a que los complejos purificados de plantas siempre contienen una mezcla heterogénea de tetrámeros con diferentes combinaciones de Chl ay Chl b ^9. Por lo tanto, se requiere un método para el montaje de WSCPs expresadas de forma recombinante con Chls in vitro. Este es desafiada por la insignificante solubilidad en agua de Chls que hace imposible ensamblar el complejo in vitro mezclando simplemente las apoproteínas solubles en agua con pigmentos en soluciones acuosas. Ensamblaje in vitro mediante la mezcla de las apoproteínas con membranas tilacoides ¹⁵ se demostró, pero este método se limita a la nativa Chls presente en los tilacoides. Schmidt et al. informaron sobre el montaje de varios derivados de Chl y BChl con PCSW de la coliflor (CaWSCP) mediante la expresión de una proteína recombinante marcado con histidina en E. coli inmovilizándolo en una columna de Ni-afinidad y la introducción de derivados de Chl solubilizan en detergentes ^11. Con éxito la reconstitución de WSCPs recombinantes a partir de A. ⁶ thaliana, y las coles de Bruselas (BoWSCP), rábano japonés salvaje (RshWSCP) unaTambién se informó d Virginia pepperweed (LvWSCP) por un método similar.

A continuación, presentamos una novela, método general y directa para el montaje de Chls con PCSW que no requiere etiquetado o la inmovilización de las proteínas. Se basa en la preparación de emulsiones de sus soluciones acuosas de los apoproteínas solubles en agua en aceite mineral. Las proteínas se encapsulan por lo tanto en agua-en-aceite (W / O) microgotas con muy alta relación de superficie a volumen ^16. Los cofactores hidrofóbicos se disuelven en el aceite y se introducen fácilmente en las gotitas de la fase de aceite. Se presenta sobre el uso del método para el montaje de varias variantes de apoproteínas PCSW recombinante expresadas en E. coli con Chl a. Se demuestra el conjunto de lisado crudo de bacterias PCSW sobreexpresan que pueden ser utilizados como un sistema de detección para el desarrollo de nuevas proteínas de unión de Chl.