המים אמולסיות שמן: מערכת חדשה להרכבת חלבונים מסיסים במים כלורופיל מחייב עם פיגמנטים הידרופובי
Summary
כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה תפוקה גבוהה להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי אשר מבוססים על אמולסיות מים-in-שמן. אנו מדגימים את היעילות של השיטה באסיפה של כלורופיל ילידים עם ארבע וריאציות של מסיס-מים כלורופיל רקומביננטי מחייבים חלבונים (WSCPs) של צמחי Brassica לידי ביטוי E. coli.
Abstract
כלורופיל (Chls) ו bacteriochlorophylls (BChls) הוא הקו-הפקטורים העיקריים המבצעות קציר פוטוסינתטיים אור העברת אלקטרונים. הפונקציונליות שלהם תלויה באופן קריטי לארגון הספציפי שלהם בתוך קומפלקסי חלבונים הטרנסממברני multisubunit גדולות ומסועפים. על מנת להבין ברמה המולקולרית איך קומפלקסים אלה להקל המרת אנרגית שמש, זה הכרחי כדי להבין חלבון-פיגמנט, ואינטראקציות פיגמנט-פיגמנט, והשפיע על דינמיקה נרגשת. אחת דרכים להשיג הבנה כזו היא על ידי בנייה ולומד קומפלקסים של Chls עם חלבונים רקומביננטיים מסיסים במים פשוטים. עם זאת, המשלב בתוכו את Chls ו BChls lipophilic לחלבונים מסיסים במים קשה. יתר על כן, אין שיטה כללית, אשר יכול לשמש להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי. הנה, אנחנו מדגימים מערכת תפוקה פשוט גבוהה המבוססת על אמולסיות מים-in-שמן, המאפשרת את תחתembly של חלבונים מסיסים במים עם Chls הידרופובי. השיטה החדשה קיבלה תוקף על ידי הרכבת גרסאות רקומביננטי של חלבון מסיס במים כלורופיל מחייב של צמחים מצליבים (WSCP) עם Chl א. אנו מדגימים את ההרכבה המוצלחת של Chl lysates גולמי באמצעות של WSCP להביע E. תא קולי, אשר עשוי לשמש לפיתוח מערכת מסך גנטי חלבונים מסיסים במים הרומן Chl מחייב, וכן לבדיקות של אינטראקציות Chl בחלבונים תהליכי ההרכבה.
Introduction
פיגמנטים הידרופובי כגון כלורופיל (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) וקרוטנואידים הם הקו-הפקטורים העיקריים במרכזי תגובה פוטוסינתטיים וחלבוני קצירת אור מבצעות העברת אלקטרונים, ללכוד את אנרגית אור והעברה. מרכזי התגובה ורוב מתחמי הקציר Chl מחייבים אור הם חלבונים הטרנסממברני. Fenna-מתיוס-אולסון (FMO) החלבון של חיידקי גופרית ירוקה פוטוסינתטיים הלא חמצנית 1,2, ואת חלבון peridinin-Chl (PCP) של dinoflagellates 3 דוגמאות יוצאות דופן של חלבוני קצירת אור מסיסים במים. החלבונים מחייבים מסיסים במים כלורופיל (WSCPs) של המצליבים, ארכוביתיים, Chenopodiaceae ו ירבוזיים צמחים 4, 5 הם עוד דוגמא ייחודית, עדיין בניגוד FMO ו PCP, אלה אינם מעורבים בקצירת אור ולא בשום התגובה פוטוסינתטיים העיקרית , ו PHY המדויק שלהםפונקציות siological הן עדיין לא ברורות 5-8. הזיקה הגבוהה Chl המחייב שלהם הובילה פונקציה הציעה כנישאים חולפים של Chls ונגזר Chl 9,10. לחלופין, זה היה שיערו כי WSCP ממלא תפקיד הדחה Chls ב תאים פגומים ומגן מפני נזק photooxidative הנגרמת Chl 7,11-13. לאחרונה, הוצע כי פונקציות WSCP כמעכב פרוטאז וממלא תפקיד במהלך התנגדות אוכלי עשב כמו גם מסדיר מוות של תאים במהלך התפתחות הפרח 14. WSCPs נחלקים לשתי קבוצות עיקריות על פי מאפייני photophysical שלהם. המחזור הראשון (אני בכיתה, למשל. מן כף אווז לבנה) עשוי לעבור photoconversion על תאורה. Class II WSCPs מצמחים Brassica, שאינם עוברים photoconversion 5,10, מחולקים נוספת לכיתה IIa (למשל., מ oleracea Brassica, sativus Raphanus) ו IIb (למשל., מן שחליים virginicum </em>). המבנה של הכיתה IIb WSCP מן שחליים virginicum נפתרה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן על 2.0 ברזולוציה 8. הוא מגלה homotetramer סימטרי שבו יחידות משנת חלבון יוצרי ליבה הידרופובי. למקטע כל נקשר Chl אחת שתוצאתה הסדר הדוק של ארבעה Chls מקרוב ארוז בתוך core.This פשוט כל הסדר Chl עושה WSCPs מערכת מודל שימושי פוטנציאלי ללימוד מחייב והרכבה של מתחמי Chl-חלבון, ואת ההשפעות של השכנה Chls וסביבות חלבון על תכונות ספקטרליות ואלקטרוניקה של Chls הפרט. יתר על כן, היא עשויה לספק תבניות לבניית חלבונים מלאכותיים Chl מחייב כי ניתן להשתמש עבור מודולים אור-קציר בהתקנים המבצעים פוטוסינתזה מלאכותית.
מחקרים קפדניים של WSCPs ילידי הארץ הם לא ריאליים כי מתחמי מטוהרי מצמחים תמיד מכילים תערובת הטרוגנית של tetramers עם שילובים שונים של Chlו Chl ב 9. לפיכך, שיטה להרכבת WSCPs recombinantly הביע עם Chls במבחנה נדרשה. זה מוטל בספק על ידי המים המסיסים הזניחה של Chls מה שהופך את זה אי אפשר להרכיב את המורכבות במבחנה פשוט על ידי ערבוב apoproteins מסיס במים עם פיגמנטים בתמיסות מימיות. במבחנת הרכבה ידי ערבוב apoproteins עם ממברנות תילקואיד 15 הודגם, אבל שיטה זו מוגבלת בהווה Chls הילידים תילקואיד. שמידט ואח '. דיווח על הרכבת כמה נגזרים Chl ו BChl עם WSCP מ כרובית (CaWSCP) על ידי recombinantly לבטא חלבון מתויג-היסטידין ב E. coli לשתק אותו על עמודה Ni-זיקה והחדרת נגזרים Chl solubilized ב דטרגנטים 11. כינון מחדש בהצלחה של WSCPs רקומביננטי מ א thaliana 6, וכרוב ניצנים (BoWSCP), צנון בר יפני (RshWSCP)ד וירג'יניה pepperweed (LvWSCP) על ידי שיטה דומה גם דווח.
כאן, אנו מציגים רומן, כללית, שיטה פשוטה להרכבת Chls עם WSCP שאינו דורש תיוג או לשתק את החלבונים. היא מסתמכת על הכנת אמולסיות מהפתרונים מהימיים שלהם של apoproteins מסיס במים בשמן מינרלים. החלבונים ובכך הם הגלום מים ב-שמן (W / O) microdroplets עם משטח גבוה מאוד יחס נפח 16. קו-פקטורים הידרופובי אז הם מומסים בשמן מוצגים בקלות לתוך טיפות משלב שמן. אנו מדווחים על השימוש בשיטה להרכבה של מספר הגירסות של apoproteins WSCP הביעו recombinantly ב E. coli עם Chl א. אנו מדגימים את ההרכבה מ lysate הגולמי של חיידקים ביתר-WSCP אשר עשוי לשמש כמערכת הקרנה לפיתוח חלבוני Chl מחייבים רומן.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה שלנו היתה לפתח מערכת חדשה כללית להרכבה של חלבונים מסיסים במים מחייב כלורופיל עם פיגמנטים הידרופובי. כאן זה מוצג שמערכת הכינון מחדש החדשה המבוססת על אמולסיה W / O היא גישה כללית הוכחה לעבוד להרכבת apoproteins WSCP מן כרוב ניצנים, כרובית, חזרת יפנית pepperweed וירג'יניה הביע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DN מודה תמיכה מן PEPDIODE פרויקטים FP7 האיחוד האירופי (GA 256,672) ו REGPOT-2012-2013-1 (GA 316,157), ומענק מחקר אישי (מס '268/10) מן הקרן הלאומית למדע. אנו מודים פרופ 'שמואל רובינשטיין, מבית הספר להנדסה מדעים, אוניברסיטת הרווארד, קיימברידג' מסצ'וסטס, ארה"ב שהקדשת תמונות מיקרוסקופיה confocal.
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
References
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -. P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA – Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
