Water in olie emulsies: Een nieuw systeem voor het samenstellen van water-oplosbare-Chlorophyll bindende eiwitten met Pigmenten Hydrofobe

Hydrofobe pigmenten zoals chlorofyl (Chls), bacteriochlorofylen (BChls) en carotenoïden zijn de primaire co-factoren in fotosynthetische reactie centra en lichte harvesting eiwitten die elektronentransport, en licht energie op te vangen en de overdracht uit te voeren. Het reactiemengsel centra en de meeste van de Chl-bindende light harvesting complexen transmembraan eiwitten. De Fenna-Matthews-Olson (FMO) eiwit van niet-oxygenic fotosynthetische groene zwavel bacteriën ^1,2, en de peridinin-Chl eiwit (PCP) van dinoflagellaten ³ zijn uitzonderlijke voorbeelden van water oplosbare licht harvesting eiwitten. De in water oplosbare chlorofyl bindende eiwitten (WSCPs) van Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae en Amaranthaceae installaties ^{4, 5} zijn een uniek voorbeeld, maar in tegenstelling tot FMO en PCP, deze zijn niet betrokken in light harvesting of in een van de primaire fotosynthetische reactie , en hun precieze physiological functies zijn nog onduidelijk ^5-8. Hun hoge Chl-bindingsaffiniteit hebben geleid tot een voorgestelde functie als tijdelijke dragers van Chls Chl en derivaten ^9,10. Als alternatief werd de hypothese dat WSCP speelt een rol in het wegvangen Chls in beschadigde cellen en beschermt tegen Chl-geïnduceerde oxidatieve schade ^7,11-13. Recenter werd gesuggereerd dat WSCP functioneert als een proteaseremmer en speelt een rol bij herbivore weerstand en reguleert celdood bij bloemontwikkeling ^14. WSCPs worden onderverdeeld in twee hoofdklassen volgens hun fotofysische eigenschappen. De eerste klasse (klasse I, bijv. Uit Chenopodium album) kan photoconversion ondergaan bij belichting. II WSCPs van Brassica planten, die niet photoconversion ^5,10 ondergaan, worden verder onderverdeeld in klasse IIa (bijv., Uit Brassica oleracea, Raphanus sativus) en IIb (bijv., Van Lepidium virginicum </em>). De structuur van de klasse IIb WSCP van Lepidium virginicum werd opgelost door röntgenkristallografie bij 2,0 Å resolutie ^8. Het openbaart een symmetrische homotetrameer waarin het eiwit subeenheden vormen een hydrofobe kern. Elke subeenheid bindt één Chl die resulteert in een strakke regeling van vier dicht opeengepakte Chls binnen core.This eenvoudige all Chl opstelling maakt WSCPs een nuttig model voor het bestuderen binding en assemblage van Chl-eiwitcomplexen, en de effecten van aangrenzende Chls en eiwit omgevingen op de spectrale en elektronische eigenschappen van individuele Chls. Bovendien kan het sjablonen voor het construeren van kunstmatige Chl-bindende eiwitten die kunnen worden gebruikt voor lichte oogsten modules in kunstmatige fotosynthetische nicatieapparatuur.

Rigoureuze studies van natief WSCPs niet haalbaar omdat de complexen gezuiverd uit planten een heterogeen mengsel van tetrameren met verschillende combinaties van een Chl bevatten altijden Chl b ^9. Aldus wordt een werkwijze voor het assembleren van recombinant tot expressie WSCPs met Chls in vitro vereist. Dit wordt uitgedaagd door de verwaarloosbare wateroplosbaarheid van Chls waardoor het onmogelijk om het complex in vitro assembleren door eenvoudig mengen van het wateroplosbare apoproteins met pigmenten in waterige oplossingen. In vitro assemblage door mengen van de apoproteïnen met thylakoïdmembranen ¹⁵ werd aangetoond, maar deze methode wordt beperkt tot de natieve Chls in de thylakoiden. Schmidt et al. rapporteerde over het monteren van een aantal Chl en BChl derivaten met WSCP van bloemkool (CaWSCP) door recombinant expressie brengen van een histidine-tag eiwit in E. coli immobiliseren deze op een Ni-affiniteitskolom en invoering Chl derivaten opgelost in ¹¹ detergentia. Succesvol reconstitutie van recombinant WSCPs van A. thaliana ^6, en spruitjes (BoWSCP), Japans wilde radijs (RshWSCP) eend Virginia pepperweed (LvWSCP) op een dergelijke manier werden ook gemeld.

Hier presenteren we een nieuwe, algemene, eenvoudige werkwijze voor het assembleren Chls met WSCP die geen tagging vereist of immobiliseren van de eiwitten. Het berust op het bereiden van emulsies van de waterige oplossingen van de wateroplosbare apoproteïnen in minerale olie. De eiwitten worden aldus ingekapseld in water-in-olie (W / O) microdruppeltjes met zeer hoog oppervlak volumeverhouding ^16. De hydrofobe cofactoren worden vervolgens opgelost in de olie en worden gemakkelijk geïntroduceerd in de druppeltjes van de oliefase. We rapporteren volgens de werkwijze voor het samenstellen van verschillende varianten van WSCP apoproteïnen recombinant tot expressie gebracht in E. coli met Chl a. We tonen het samenstel uit ruw lysaat van WSCP overexpressie bacteriën die kunnen worden gebruikt als een screening voor de ontwikkeling van nieuwe Chl eiwitten.