Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem
Summary
Bu yazıda, su içinde yağ emülsiyonları göre hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler monte edilmesi için, basit ve yüksek verimli bir yöntem tarif eder. Biz Brassica bitkileri E. ifade rekombinant suda çözünür-klorofil dört varyant bağlayıcı proteinler (WSCPs) ile yerli klorofil montajında yöntemin etkinliğini gösteren E. coli.
Abstract
Klorofil (Chls) ve bacteriochlorophylls (BChls) fotosentez ışık hasat ve elektron taşıma yürütmek birincil kofaktörleridir. Onların işlevselliği eleştirel büyük ve ayrıntılı birden fazla alt transmembran protein komplekslerinin içinde kendi özel organizasyon bağlıdır. Bu kompleksler güneş enerjisi dönüşüm nasıl kolaylaştıracağını moleküler düzeyde anlamak için, protein-pigment ve pigment pigment etkileşimleri ve heyecanlı dinamikleri üzerindeki etkisini anlamak için önemlidir. Bu bulgu elde etmenin bir yolu oluşturmak ve basit suda çözünür rekombinant proteinlerle Chls komplekslerini inceleyerek gereğidir. Bununla birlikte, suda çözünür protein halinde lipofilik Chls ve BChls içeren zordur. Ayrıca, hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler montajı için kullanılabilir genel bir yöntem vardır. Burada, eşek sağlayan su içinde yağ emülsiyonları dayalı basit ve yüksek verimli sistemi göstermektedirhidrofobik Chls suda çözünür proteinlerin embly. Yeni yöntem Chl, bir ile Brassicaceae bitki (WSCP) suda çözünür klorofil bağlayıcı proteinin rekombinan versiyonları monte ile doğrulandı. Biz Chl başarılı derleme E. ifade WSCP bir kullanarak ham lizatları göstermek suda çözülebilen yeni bir Chl bağlayıcı proteinler için genetik ekran sistemi geliştirmek için kullanılabilir ve Chl-protein etkileşimleri ve montaj işlemlerinin çalışmalar için edilebilir coli hücre.
Introduction
Bu tür klorofil (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) ve karotenoidler gibi hidrofobik pigmentler elektron taşıma ve ışık enerjisi yakalama ve transfer yürütmek fotosentetik reaksiyon merkezleri ve hafif hasat proteinler birincil kofaktörleridir. Reaksiyon merkezleri ve Chl bağlayıcı ışık toplayıcı komplekslerinin en transmembran proteinlerdir. Olmayan oksijenik fotosentez yeşil-sülfür bakterilerin 1,2 Fenna-Matthews-Olson (FMO), protein, ve dinoflagellatlar 3 peridinin-Chl proteini (PCP) suda çözünür ışık toplayıcı proteinlerin olağanüstü örneklerdir. Suda çözünür klorofil bağlama proteinleri (WSCPs) Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae ve Amaranthaceae bitkiler 4, 5, başka bir eşsiz bir örnek, henüz FMO ve PCP aksine, bu hafif hasat ne de birincil fotosentetik reaksiyon herhangi de katılmaktadırlar ve onların kesin physiological fonksiyonları henüz 5-8 belirsizdir. Bunların yüksek Chl-bağlama çekiciliği, geçici Chls taşıyıcıları ve CHİ türevleri 9,10 olarak önerilen bir işleve yol açmıştır. Seçenek olarak ise, bu WSCP zarar hücrelerde Chls tutucu bir rol oynar ve Chl kaynaklı fotooksidatif hasara 7,11-13 karşı koruma olduğu varsayılmıştır. Daha yakın zamanda, bir proteaz inhibitörü olarak bu WSCP işlevleri ileri ve otçul direnci sırasında önemli bir rol oynar gibi çiçek gelişimi 14 esnasında hücre ölümünü düzenlemektedir. WSCPs kendi fotofiziksel özelliklere göre iki ana sınıfa ayrılır. Birinci sınıf (sınıf I, örneğin. Chenopodium albümünden) aydınlatma üzerine Fotoçevrim uğrayabilir. Fotoçevrim 5,10 uğramayan Brassica bitkileri, gelen Sınıf II WSCPs, başka bir sınıfı IIa bölünmüştür (örn., Brassica oleracea, Raphanus sativus elde edilmiş) ve IIb (örn., Lepidium virginicum gelen </em>). Lepidium virginicum Sınıf IIb WSCP yapısı 2.0 Å çözünürlükte 8 X-ışını kristalografisi tarafından çözüldü. Bu protein alt-birimleri, bir hidrofobik çekirdek oluşturan bir simetrik homotetramer ortaya koymaktadır. Her bir alt-birimi, tüm Chl düzenlemesi Chl-protein kompleksleri bağlanmasını ve montaj çalışmaları için WSCPs potansiyel olarak yararlı bir model sistemi sağlar, basit core.This içinde dört yakından dolu Chls sıkı bir düzenleme ile sonuçlanan tek bir CHL ve Chls komşu etkilerini bağlanan ve bireysel Chls spektral ve elektronik özellikleri protein ortamları. Ayrıca, yapay fotosentetik cihazlar ışık hasat modüller için kullanılabilir yapay Chl bağlayıcı proteinler oluşturmak için şablon sağlayabilir.
Bitkilerden izole kompleksleri her Chl a farklı kombinasyonları ile tetramerleri heterojen bir karışımı içerdiğinden nativ WSCPs titiz çalışmaları mümkün değildirve Chl b 9. Bu nedenle, in vitro Chls ile rekombinant olarak ifade WSCPs monte edilmesi için bir yöntem olup gereklidir. Bu 15 gösterilmiştir tilakoit membranlarla apoprotein karıştırarak. Imkansız basit sulu çözeltiler içinde pigmentler ile suda çözünür apoprotein karıştırılmasıyla in vitro kompleks montajı yapar Chls ihmal edilebilir suda çözünürlüğü ile in vitro olarak toplanması meydan, ama Bu yöntem, Thylakoid'in nativ Chls mevcut sınırlıdır. Schmidt ve ark. rekombinant olarak E. bir histidin-etiketli proteini ifade ederek karnıbahar (CaWSCP) den WSCP ile birkaç Chl ve BChl türevleri montaj bildirildi E. coli, bir Ni-afinite sütunu üzerine hareketsiz ve deterjanlar 11 içinde çözünür Chl türevleri sokulması. Başarıyla A. Rekombinant WSCPs yeniden oluşturulması thaliana 6, ve Brüksel lahanası (BoWSCP), Japon turp (RshWSCP) birbenzer bir yöntemle D Virginia pepperweed (LvWSCP) bildirilmiştir.
Burada, bir roman, proteinler etiketleme gerektirmez WSCP ile Chls montaj veya immobilize genel, basit bir yöntem mevcut. Mineral yağ içinde suda çözünür apoproteinlerden sulu çözeltilerden emülsiyonları hazırlamak dayanır. Proteinleri, hacim oranı 16 su-içinde-yağ (o / w), çok yüksek bir yüzey ile mikro damlacıklar içinde kapsüllenir. hidrofobik kofaktör daha sonra yağ içinde eritilir ve hali hazırda yağ fazından damlacıklar halinde yerleştirilir. Biz rekombinant olarak E. ifade WSCP apoproteinlerden çeşitli türevleri montajı için yöntem kullanılarak rapor Chl bir ile E. coli. Bu yeni Chl bağlayıcı proteinler geliştirmek için bir eleme sistemi olarak kullanılabilir WSCP-aşırı ifade eden bakteriler, ham lizat düzeneğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Amacımız, hidrofobik pigmentler ile suda çözünür klorofil bağlama proteinlerinin kurulması için bir yeni genel sistem geliştirmektir. Burada W / O emülsiyon dayalı yeni sulandırma sistemi rekombinant olarak E. ifade Brüksel lahanası, karnabahar, Japon horseradish ve Virginia pepperweed gelen WSCP apoproteinlerden montajı için çalışmaya kanıtlanmış genel bir yaklaşım olduğu gösterilmiştir E. coli. Burada sonuç Chl, bir 10-misli molar fazlası ile WSCP 1 mg yeniden o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DN AB 7.ÇP projelerinin PEPDIODE (GA 256672) ve REGPOT-2012-2013-1 (GA 316157), ve İsrail Bilim Vakfı kişisel bir araştırma bursu (No 268/10) destek kabul eder. Biz konfokal mikroskopi görüntüleri çekmek için Prof. Shmuel Rubinstein, Mühendislik Okulu ve Uygulamalı Bilimler, Harvard Üniversitesi, Cambridge MA, ABD teşekkür ederim.
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
References
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -. P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA – Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
