הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים
Summary
By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.
Abstract
שימוש בעוברי עוף אפשר לבדוק ישירות את ההשפעות של שני גורמי גדילה או מעכבים ספציפיים של מסלולי איתות על ביטוי גנים והפעלה של מסלולי העברת אותות. טכניקה זו מאפשרת המשלוח של מולקולות איתות בשלבי התפתחות מוגדרות במדויק לזמנים מסוימים. לאחר ניתן לקצור זו עוברים וביטוי גנים בדקו, למשל, על ידי הכלאה באתר, או הפעלה של מסלולי העברת אותות נצפו עם immunostaining.
בחרוזים זה וידאו הפרין הספוג בFGF18 או חרוזים 1-X2 AG הספוג בU0126, מעכב MEK, הם מורכבים לניצן האיבר באוב. זה מראה כי FGF18 גורם ביטוי של Myod וזירחון ERK וביטוי Myod שני אנדוגני וFGF18 המושרה הוא מעוכב על ידי U0126. חרוזים הספוגים באנטגוניסט חומצה רטינואית יכולים להגביר אינדוקציה Myod מוקדמת על ידי FGF18.
גישה זו יכולה להיות לנואד עם מגוון רחב של גורמים שונים צמיחה ומעכבים ומותאם בקלות לרקמות אחרות בעובר המתפתח.
Introduction
עוברי עופות סיפקו כלי רב עוצמה ללימוד פיתוח במשך שנים רבות 1. אחד מהמאפיינים השימושיים ביותר שלהם הוא שהם קלים יחסית לתמרן. פיתוח חיצוני מאפשר לפתוח את הביצה כדי לגשת לעובר ולבצע micromanipulations השונים, כולל דוגמאות, כגון מערכת הכימרה שליו-חומוס הקלאסית ללימוד תא גורל 2,3, ההזרקה של רטרווירוסים לביטוי יתר ברקמות ספציפיות במהלך פיתוח 4,5 ותרבות explant לזהות מקורות איתות התפתחותית 6. לאחרונה מפלצות שנוצרו בין מארחים ללא תווית עם שתלים מקו עוף מהונדס להביע GFP הראה כי שילוב של השתלה קלסית ושינוי גנטי יכול לספק תובנות חשובות פיתוח 7,8.
הקלות שבה ניתן להשפיע עובר העופות הפכה אותו מודל מצוין לחקר איברפיתוח 9. היישום של גורמי גדילה ספציפיים לאיברי פיתוח in vivo כבר סייע בזיהוי גורמים המשנים דפוסי איבר 10,11 וממשיך לספק תובנות תהליך זה 12. גישה זו שימשה גם כדי ללמוד את הגורמים המווסתים את התפתחות שרירים וחשפה תפקידים למספר רבים של אותות כגון 13 Wnts, 14 ו -15 BMPs HGF.
לאחרונה טכניקה זו נעשתה שימוש כדי לחקור את אותות שליטה ביטוי גני myogenic בניצן האיבר והראתה כי אינטראקציות בין FGF18 וחומצה רטינואית יכולות לשלוט על העיתוי של ביטוי Myod 16. באמצעות שילוב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות שניתן לטעון על חרוזים ולאחר מכן השתילו ישירות לתוך רקמות ספציפיות בשלבי התפתחות מוגדרים נותנת ההזדמנות להתערב כמעט בכל זמן ובאזור במהלך פיתוח. זה נעשה שימוש כדי Investigate תהליכים רבים, כולל דפוסי somite 17,18, מפרט עצבי 19, הגירה עצבית פסגת 20 והארכת ציר 21.
כאן אנו מתארים שיטה להשתלת חרוזים ספוגים באו גורמי גדילה או מעכבים לפיתוח גפיים עוף. זה נעשה שימוש כדי לקבוע את ההשפעות של אותות אלה על ידי ניתוח myogenesis ביטוי שריר גן ספציפי עם הכלאה באתר. אנו מתארים שתלים או באמצעות חרוזים הפרין ספוגים, המשמשים לגורמי גדילה, או חרוזים 1-X2 AG למולקולות קטנות הידרופובי כגון חומצה רטינואית או מעכבי מולקולה קטנים של מסלולי איתות ספציפיים. עם זאת חרוזים אחרים זמינים גם אשר היו בשימוש כדי לספק את שני 22 FGFs ושש 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש בשתלי חרוז מיושמים ישירות לפיתוח רקמות באובו הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח את התפקיד של איתות גורם גדילה במהלך הפיתוח נותן שליטה ללא תחרות על השלב ההתפתחותי שבו הם מיושמים ומשך חשיפה.
הבחירה של החרוזים לכל סוג של מולקולה חשובה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.
Materials
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
References
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Bell, E., Brickell, P. Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo. Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).
- Abu-Elmagd, M., et al. Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis. Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).
- Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite. Development. 121, 651-660 (1995).
- McGrew, M. J., et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).
- Valasek, P., et al. Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle. Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
- Rosello-Diez, A., Torres, M. Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells. Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).
- Anakwe, K., et al. Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing. Development. 130, 3503-3514 (2003).
- Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. The importance of timing differentiation during limb muscle development. Current Biology. 8, 642-652 (1998).
- Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo. Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).
- Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts. Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).
- Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5. Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).
- Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals. Development. 127, 4105-4113 (2000).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Martinez-Morales, P. L., et al. FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk. Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).
- Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension. Development. 134, 2125-2135 (2007).
- Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity. Development. 125, 2825-2835 (1998).
- Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes. Development. 125, 777-790 (1998).
- Sweetman, D., et al. FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos. Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).
- Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals. BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).
- Scott, B. B., Lois, C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).
- Seidl, A. H., et al. Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).
