مسمار الخرز في تطوير الدجاج أطراف الجنين لتحديد مسارات نقل الإشارة التي تؤثر على التعبير الجيني
Summary
By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.
Abstract
باستخدام أجنة الدجاج فمن الممكن لاختبار مباشرة آثار إما عوامل النمو أو مثبطات محددة من مسارات إشارات على التعبير الجيني وتفعيل مسارات نقل الإشارة. هذه التقنية تتيح إيصال إشارات الجزيئات في مراحل نمو محددة بدقة لأوقات محددة. بعد هذه الأجنة يمكن حصاده ودراسة التعبير الجيني، على سبيل المثال عن طريق التهجين الموضعي، أو تفعيل مسارات نقل الإشارة لاحظ مع المناعية في.
في هذا الفيديو حبات الهيبارين غارقة في FGF18 أو AG الخرز 1-X2 غارقة في U0126، مثبط مجاهدي خلق، والمطعمة في برعم الطرف في البيضة. هذا يدل على أن FGF18 يدفع التعبير عن MyoD وERK الفسفرة وكلا الذاتية وFGF18 الناجم عن التعبير MyoD وتحول دون U0126. يمكن الخرز غارقة في خصم حمض الريتينويك تحفيز سابق لأوانه MyoD تحريض من قبل FGF18.
هذا النهج يمكن أن يكون لناإد مع مجموعة واسعة من عوامل النمو المختلفة، ومثبطات وتتكيف بسهولة إلى الأنسجة الأخرى في الجنين النامي.
Introduction
وقد وفرت أجنة الطيور أداة قوية لدراسة تطوير لسنوات عديدة 1. واحدة من خصائصها الأكثر فائدة هي أنها سهلة نسبيا للتلاعب. تنمية الخارجية يجعل من الممكن لفتح البيض للوصول إلى الجنين وأداء micromanipulations المختلفة بما في ذلك أمثلة مثل نظام الوهم السمان-فرخ الكلاسيكية لدراسة مصير خلية 2،3، وحقن الفيروسات القهقرية لoverexpression في أنسجة معينة أثناء نمو 4،5 والثقافة يزدرع لتحديد مصادر الإشارات التنموية 6. وفي الآونة الأخيرة الوهم ولدت بين المضيفين الخالي من الملصقات مع الطعوم من خط الدجاج المعدل وراثيا معربا عن GFP أظهرت أن الجمع بين التطعيم الكلاسيكية والتعديل الوراثي يمكن أن توفر معلومات هامة في التنمية 7،8.
جعلت السهولة التي يمكن التلاعب بها الجنين الطيور يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة أطرافهمتنمية 9. وقد تم تطبيق عوامل النمو محددة لأطرافه النامية في الجسم الحي دورا أساسيا في تحديد العوامل التي تغير الطرف الزخرفة 10،11 ويستمر في تقديم رؤى في هذه العملية 12. كما تم استخدام هذا النهج لدراسة العوامل التي تنظم تنمية العضلات وكشفت عن العديد من الأدوار إشارات مثل Wnts 13، 14 أفضل الممارسات الإدارية وHGF 15.
مؤخرا تم استخدام هذه التقنية للتحقيق في إشارات التحكم عضلي التعبير الجيني في برعم الطرف، وأظهرت أن التفاعلات بين FGF18 وحمض الريتينويك يمكن السيطرة على توقيت MyoD التعبير 16. باستخدام مزيج من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة التي يمكن تحميلها على حبات ثم المطعمة مباشرة إلى أنسجة معينة في مراحل نمو محددة يعطي فرصة للتدخل في أي وقت تقريبا والمنطقة خلال التنمية. وقد استخدم هذا إنفيstigate العديد من العمليات بما في ذلك الجسيدة الزخرفة 17،18، مواصفات العصبية 19، العصبية الهجرة قمة 20 و محور التمديد 21.
نحن هنا تصف طريقة لتطعيم حبات غارقة في أي عوامل النمو أو مثبطات في تطوير أطرافه الدجاج. وقد استخدم هذا لتحديد آثار هذه الإشارات على تكون العضل عن طريق تحليل العضلات التعبير جين معين مع التهجين في الموقع. وصفنا ترقيع باستخدام الهيبارين غارقة الخرز، والتي تستخدم لعوامل النمو، أو AG الخرز 1-X2 لجزيئات صغيرة مسعور مثل حمض الريتينويك أو مثبطات جزيء صغير من مسارات إشارات محددة. ومع ذلك الخرز الأخرى المتاحة والتي تم استخدامها لتقديم كل عوامل النمو FGFs 22 و Shh على 23 أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الطعوم حبة تطبيقها مباشرة على الأنسجة النامية في البيضة هو أداة قوية لتشريح دور عامل النمو الإشارات خلال تطوير يعطي سيطرة لا مثيل لها خلال المرحلة التنموية التي يتم تطبيقها ومدة التعرض.
اختيار حبة لكل نوع من جزيء مهم. الج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.
Materials
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
References
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Bell, E., Brickell, P. Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo. Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).
- Abu-Elmagd, M., et al. Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis. Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).
- Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite. Development. 121, 651-660 (1995).
- McGrew, M. J., et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).
- Valasek, P., et al. Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle. Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
- Rosello-Diez, A., Torres, M. Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells. Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).
- Anakwe, K., et al. Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing. Development. 130, 3503-3514 (2003).
- Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. The importance of timing differentiation during limb muscle development. Current Biology. 8, 642-652 (1998).
- Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo. Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).
- Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts. Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).
- Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5. Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).
- Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals. Development. 127, 4105-4113 (2000).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Martinez-Morales, P. L., et al. FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk. Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).
- Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension. Development. 134, 2125-2135 (2007).
- Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity. Development. 125, 2825-2835 (1998).
- Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes. Development. 125, 777-790 (1998).
- Sweetman, D., et al. FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos. Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).
- Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals. BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).
- Scott, B. B., Lois, C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).
- Seidl, A. H., et al. Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).
