Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica
Summary
By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.
Abstract
El uso de embriones de pollo es posible probar directamente los efectos de cualquiera de los factores de crecimiento o inhibidores específicos de las vías de señalización sobre la expresión génica y la activación de vías de transducción de señal. Esta técnica permite la entrega de moléculas de señalización en las etapas de desarrollo definidas con precisión para momentos específicos. Después de esto, los embriones pueden ser cosechadas y examinaron la expresión de genes, por ejemplo mediante hibridación in situ, o activación de las vías de transducción de señales observados con la inmunotinción.
En vídeo perlas de heparina empapados en FGF18 o AG perlas 1-X2 empapados en U0126, un inhibidor de MEK, están injertados en el esbozo de la extremidad in ovo. Esto demuestra que FGF18 induce la expresión de MyoD y la fosforilación de ERK y la expresión MyoD tanto endógenas como inducida FGF18 es inhibida por U0126. Cuentas empapados en un antagonista del ácido retinoico pueden potenciar la inducción prematura MyoD por FGF18.
Este enfoque puede ser nosotrosed con una amplia gama de diferentes factores de crecimiento e inhibidores y se adapta fácilmente a otros tejidos en el embrión en desarrollo.
Introduction
Embriones de aves han proporcionado una poderosa herramienta para el estudio del desarrollo durante muchos años 1. Una de sus características más útiles es que son relativamente fáciles de manipular. Desarrollo externo hace que sea posible abrir el huevo para acceder al embrión y realizar diversas micromanipulaciones incluyendo ejemplos tales como el sistema quimera codorniz-chick clásico para estudiar el destino celular 2,3, la inyección de los retrovirus para la sobreexpresión en tejidos específicos durante el desarrollo 4,5 y la cultura explante para identificar las fuentes de señalización de desarrollo 6. Más recientemente quimeras generada entre hosts sin marcar con injertos de una línea de pollo transgénico que expresa GFP ha demostrado que la combinación de injerto clásica y la modificación genética puede proporcionar importantes conocimientos sobre el desarrollo de 7,8.
La facilidad con la que el embrión aviar puede ser manipulado ha hecho que sea un modelo excelente para el estudio de las extremidadesdesarrollo 9. La aplicación de factores de crecimiento específicos para los miembros en desarrollo in vivo ha sido fundamental en los factores que alteran los patrones extremidad 10,11 y continúa proporcionando conocimientos sobre este proceso 12 identificación. Este enfoque también se ha utilizado para estudiar los factores que regulan el desarrollo muscular y ha descubierto roles para numerosas señales tales como Wnts 13, BMPs 14 y 15 HGF.
Recientemente, esta técnica se ha utilizado para investigar las señales que controlan la expresión génica en myogenic la yema del miembro y ha demostrado que las interacciones entre FGF18 y el ácido retinoico puede controlar el momento de la expresión de MyoD 16. Usando una combinación de factores de crecimiento y moléculas pequeñas que se pueden cargar en perlas y luego injertados directamente en los tejidos específicos en las etapas de desarrollo definidas da la oportunidad de intervenir en casi cualquier momento y la región durante el desarrollo. Esto ha sido utilizado para investigate muchos procesos incluyendo somito patrones 17,18, especificación neural 19, la migración de la cresta neural 20 y la extensión del eje 21.
Aquí se describe un método para injertar perlas empapadas en cualquiera de los factores de crecimiento o inhibidores en el desarrollo de las extremidades de pollo. Esto ha sido utilizado para determinar los efectos de estas señales en la miogénesis mediante el análisis de la expresión génica específica de músculo con hibridación in situ. Se describen injertos utilizando heparina empapada perlas, que se utilizan para factores de crecimiento, o perlas de AG 1-X2 para las pequeñas moléculas hidrófobas tales como el ácido retinoico o inhibidores de moléculas pequeñas de las vías de señalización específicas. Sin embargo otras perlas están también disponibles que se han utilizado para ofrecer tanto FGFs 22 y 23 Shh.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de injertos de cuentas aplicados directamente al desarrollo de tejidos in ovo es una herramienta poderosa para diseccionar el papel de la señalización del factor de crecimiento durante el desarrollo dando un control sin precedentes sobre el estado de desarrollo en que se aplican y la duración de la exposición.
La elección del talón para cada tipo de molécula es importante. Moléculas hidrofóbicas pequeños, tales como los inhibidores aquí descritos y el ácido retinoico, por …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.
Materials
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
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