Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression
Summary
By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.
Abstract
Met behulp van kippenembryo's is het mogelijk om direct de effecten van beide groeifactoren of specifieke remmers van signaaltransductiewegen op genexpressie en activering van signaaltransductieroutes testen. Deze techniek maakt de afgifte van signaalmoleculen op exact gedefinieerde ontwikkelingsstadia specifieke tijden. Na deze embryo's kunnen worden geoogst en genexpressie onderzocht, bijvoorbeeld door in situ hybridisatie, of activering van signaaltransductieroutes waargenomen met immunokleuring.
In deze video heparine kralen gedrenkt in FGF18 of AG 1-X2 kralen gedrenkt in U0126, een MEK-inhibitor, worden geënt in de ledematen kiem in ovo. Hieruit blijkt dat FGF18 induceert expressie van MyoD en ERK fosforylatie en zowel endogene als FGF18 MyoD geïnduceerde expressie wordt geremd door U0126. Kralen gedrenkt in een retinoïnezuur antagonist kan voortijdige MyoD inductie versterken door FGF18.
Deze aanpak kan onsed met een groot aantal verschillende groeifactoren en remmers en wordt gemakkelijk aangepast aan andere weefsels in het ontwikkelende embryo.
Introduction
Aviaire embryo's een krachtig hulpmiddel voor de studie van ontwikkeling bedoeld jaren 1. Een van hun meest nuttige eigenschappen is dat ze relatief gemakkelijk te manipuleren. Externe ontwikkeling maakt het mogelijk om het ei te openen om het embryo en uitvoeren van verschillende micromanipulations met voorbeelden zoals de klassieke kwartel-chick chimera voor het bestuderen lot van de cel 2,3, de injectie van retrovirussen voor overexpressie in specifieke weefsels tijdens de ontwikkeling 4,5 en explantatie cultuur ontwikkelingsstoornissen signalering bronnen 6 identificeren. Meer recent hersenschimmen gegenereerd tussen ongelabelde gastheren met enten van een transgene kippen lijn die GFP heeft aangetoond dat de combinatie van klassieke enten en genetische modificatie belangrijke inzichten kunnen geven in de ontwikkeling van 7,8.
Het gemak waarmee het aviaire embryo kan worden gemanipuleerd heeft gemaakt een uitstekend model voor de studie ledematenontwikkeling 9. Toepassing van specifieke groeifactoren aan de ontwikkeling van ledematen in vivo is behulpzaam geweest bij het identificeren van factoren die ledematen patronen 10,11 veranderen en blijft om inzicht te geven in dit proces 12 geweest. Deze aanpak is ook gebruikt om de factoren die spierontwikkeling regelen bestuderen en heeft rollen voor diverse signalen zoals Wnts 13, BMP's 14 en 15 HGF blootgelegd.
Recent werd deze techniek gebruikt om de signalen te besturen myogene genexpressie in de ledemaatknop onderzoeken en blijkt dat de interacties tussen FGF18 en retinoïnezuur het tijdstip van MyoD expressie 16 kan besturen. Met een combinatie van groeifactoren en kleine moleculen die op kralen kunnen worden geladen en vervolgens direct geënt in specifieke weefsels in ontwikkelingsstadia gedefinieerde geeft de mogelijkheid om op bijna elk moment en omgeving ingrijpen tijdens de ontwikkeling. Deze is gebruikt om INVEstigate veel processen waaronder somiet patroonvorming 17,18, neurale specificatie 19, neurale lijst migratie 20 en as uitbreiding 21.
Hier beschrijven we een werkwijze voor het enten korrels geweekt in beide groeifactoren of inhibitors in ontwikkelende kippenembryo ledematen. Deze is gebruikt om het effect van deze signalen op myogenesis bepalen door het analyseren spieren genexpressie met in situ hybridisatie. We beschrijven implantaten met behulp van heparine geweekte korrels, die worden gebruikt voor groeifactoren of AG 1-X2 parels voor kleine hydrofobe moleculen zoals retinoïnezuur of kleine molecule inhibitoren van specifieke signaleringsroutes. Maar andere kralen zijn ook beschikbaar, die zijn gebruikt om zowel FGF's 22 en 23 Shh leveren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van kralen grafts rechtstreeks op ontwikkelende weefsels in ovo is een krachtig hulpmiddel om de rol van de groeifactor signalering ontleden tijdens de ontwikkeling die ongekende controle over het ontwikkelingsstadium waarin zij worden toegepast en de blootstellingsduur.
De keuze van de kraal voor elk type molecuul van belang. Kleine hydrofobe moleculen, zoals beschreven remmers en retinoïnezuur, goed binden gewoonlijk gederivatiseerde AG 1-X2 korrels hoewel het noodzakelijk om …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.
Materials
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
References
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Bell, E., Brickell, P. Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo. Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).
- Abu-Elmagd, M., et al. Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis. Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).
- Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite. Development. 121, 651-660 (1995).
- McGrew, M. J., et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).
- Valasek, P., et al. Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle. Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
- Rosello-Diez, A., Torres, M. Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells. Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).
- Anakwe, K., et al. Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing. Development. 130, 3503-3514 (2003).
- Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. The importance of timing differentiation during limb muscle development. Current Biology. 8, 642-652 (1998).
- Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo. Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).
- Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts. Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).
- Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5. Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).
- Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals. Development. 127, 4105-4113 (2000).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Martinez-Morales, P. L., et al. FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk. Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).
- Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension. Development. 134, 2125-2135 (2007).
- Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity. Development. 125, 2825-2835 (1998).
- Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes. Development. 125, 777-790 (1998).
- Sweetman, D., et al. FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos. Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).
- Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals. BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).
- Scott, B. B., Lois, C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).
- Seidl, A. H., et al. Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).
