Eine Referenz Broth Mikrodilutionsverfahren für Dalbavancin<em> In-vitro-</em> Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien, die wachsen aerob
Summary
Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.
Abstract
Antimikrobielle Empfindlichkeitstests (AST) ausgeführt, um die in vitro-Aktivität von Antibiotika gegen verschiedene Bakterien zu beurteilen. AST-Ergebnisse, die als minimale Hemmkonzentration (MHK), ausgedrückt werden, werden in der Forschung zur Entwicklung und Überwachung antimikrobielle Resistenzentwicklung und bei der klinischen Einstellung für die antimikrobielle Therapie Führung verwendet. Dalbavancin ist ein halbsynthetisches lipoglycopeptide antimikrobielle Mittel, die Mai 2014 von der Food and Drug Administration (FDA) für die Behandlung von akuten bakteriellen Haut- und Hautstruktur-Infektionen durch Gram-positive Organismen verursacht genehmigt wurde. Der Vorteil Dalbavancin über aktuelle Anti-Staphylokokken-Therapien ist die lange Halbwertszeit, die für die Dosierung einmal pro Woche erlaubt. Dalbavancin eine Aktivität gegen Staphylococcus aureus (einschließlich Methicillin-empfindlichen S. aureus [MSSA] und Methicillin-resistente S. aureus [MRSA]), Koagulase-negative Staphylokokken, <em> Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus Gruppe, β-hämolytischen Streptokokken und Enterokokken Vancomycin empfindlich. Ähnlich wie bei anderen bisherigen lipoglycopeptide Mittel, Optimierung CLSI und ISO Brühe Empfindlichkeits-Testverfahren umfaßt die Verwendung von Dimethylsulfoxid (DMSO) als Lösungsmittel bei der Herstellung von Stammlösungen und Polysorbat 80 (P80), um die Haftung des Mittels an Kunststoff zu vermindern. Vor den klinischen Studien und in der Anfangsphase der Entwicklung Dalbavancin wurden Anfälligkeit Studien nicht mit der Verwendung von P-80 durchgeführt und die MIC-Ergebnisse tendenziell 2-4-fach höher und entsprechend höheren MIC Ergebnisse wurden mit dem Agar-Verdünnungs Suszeptibilität Verfahren erhalten. Dalbavancin wurde erstmals im CLSI-Bouillon-Mikroverdünnungsmethode Tische im Jahr 2005 aufgenommen und im Jahr 2006 geändert, um die Verwendung von DMSO und P-80 zu klären. Die Brühe microdilution (BMD) hier gezeigte Verfahren ist spezifisch für Dalbavancin und ist in Übereinstimmung mit den CLSI und ISO-Verfahren, mit Schritt-für-Schritt-Detail und focuns auf die kritischen Schritte hinzugefügt für Klarheit.
Introduction
Dalbavancin ist ein halbsynthetisches lipoglycopeptide die von der FDA Mai 2014 für die Behandlung von akuten bakteriellen Haut- und Hautstruktur-Infektionen durch grampositive Organismen 1 verursacht genehmigt wurde. Das primäre Ziel der Detaillierung diese Methode in einer Video-Format ist es, klare Leitlinien zu den klinischen Labors und Wissenschaftler für die Prüfung und Berichterstattung über genaue und reproduzierbare Dalbavancin Anfälligkeit Ergebnisse zu liefern.
Die Bestimmung eines antimikrobiellen Mittels MIC durch kommerzielle Verfahren routinemßig in klinischen Laboratorien zur Beurteilung der in-vitro-Aktivität des Agenten gegen pathogene Bakterien durchgeführt. Die hier beschriebene Methode ist die Bouillon-Mikroverdünnungsverfahren, wie durch CLSI und ISO 2,3,4 empfohlen. Seit Dalbavancin kommerziellen Anfälligkeit Verfahren sind derzeit nicht erhältlich (zum Zeitpunkt dieser Veröffentlichung) und Disk Diffusion und Agar-Verdünnungsverfahren sind derzeit nicht empfohlen foder Dalbavancin, sind Referenzbouillonverdünnungsverfahren die gegenwärtigen Möglichkeiten 12,14. Da diese Referenzmethode ist keine kommerzielle und FDA in vitro-Diagnoseverfahren, klinische Labors in den USA, die dieses Verfahren für die Patiententests verwenden müssen von regulatorischen Anforderungen für ein Labor entwickelten Tests (LDT) einzuhalten. Es wird erwartet, dass, wie die Dalbavancin Nutzung steigt, mehr Labors wird eine Notwendigkeit, diese Verbindung zu testen. Vancomycin Testen als Ersatz für die Bestimmung der Empfänglichkeit von S. Dalbavancin aureus wurde validiert 5. Jedoch kann Dalbavancin gegen Vancomycin Zwischen S. aktiv sein aureus (VISA) und daher kann Kliniker Dalbavancin MIC Ergebnisse verlangen. Zusätzlich kann MIC-Ergebnisse für andere Bakterienarten angefordert werden.
Die FDA anfällig Haltepunkt für Dalbavancin gegen S. aureus wurde auf ≤0.12 ug / ml festgestellt. FDA zugeordnet nur susceptible Kategorie, da der Mangel an Daten über resistente Isolate. Die normalen MIC Verteilung unter den Wildtyp-S aureus-Isolaten ist zwischen 0,03 bis 0,12 ug / ml, mit einem klaren modalen MIC von 0,06 ug / ml. Eine leichte Veränderung der MIC Ergebnisse durch Verfahren Differenz, zusätzlich zu der inhärenten BMD Variation ± eine Verdünnung, die möglicherweise haben könnte erhebliche Auswirkungen auf die Anfälligkeit Raten. 6 Ähnlich wie bei anderen lipoglycopeptide Mittel, können Dalbavancin Empfindlichkeitsprüfung anspruchs als Folge sein der Löslichkeit und der relativ großen Grße des Moleküls und seine Bindungseigenschaften 7.8.9. Die hier beschriebenen Referenz BMD Verfahren umfasst zwei spezifische Schritte, die einzigartig für unlösliche Wirkstoffe und / oder lipoglycopeptide Mittel sind: (1) die Verwendung von DMSO zur Herstellung von Stammlösungen und (2) Zugabe von 0,002% P-80 in der endgültigen MIC Panel Verdünnungen. Das Ziel dieser Veröffentlichung ist die Video Klarheit in den Dalbavancin BMD Verfahren und Spezifika bereitzustellenlly konzentrieren sich auf diese wichtigen Schritte, um genaue und reproduzierbare MIC Ergebnisse zu gewährleisten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die folgenden Verfahren Details werden für zusätzliche Überlegungen bei der Vorbereitung für Dalbavancin MHK-Bestimmung. Das Design des MIC Panel wird abhängig von der Anzahl von antimikrobiellen Mitteln zu prüfenden (das heißt., Dalbavancin allein oder mehrere Agenten) und die Bakterienspezies getestet werden kann. Die Dalbavancin Konzentrationen sollten die interpretative Haltepunkte für alle für mindestens eine QC-Stamm erwartet Bakterienarten getestet werden und den gesamten Bereich der Verdünnungen zu umfassen. Die antimikrobielle Verdünnungsreihe entweder in Zeilen oder Spalten, je nach Anzahl antimikrobieller Mittel und / oder isoliert / Platte und das Verfahren der Inokulation durchgeführt werden. Das Volumen des Pulvers und Dalbavancin Brühe berechnet werden sollte, um sicherzustellen, daß optimale Mengen produziert und Abfall ist gering. Für die in dieser Publikation verwendeten Beispiel werden die Umsätze auf Herstellung von zwei MIC-Panels basiert. Kation eingestellt Mueller-Hinton-Brühe sollte nach Mann vorbereitet und autoklavierbarsteller Anweisungen und Sterilität der Medien überprüft. MIC-Panels hergestellt und am selben Tag der Herstellung verwendet werden oder sie können mit entsprechenden Qualitätskontrollorganismen und der validierten Platten gefroren gelagert für die zukünftige Verwendung zu prüfen. Es ist wichtig, sterile Techniken in dem Verfahren zu verwenden.
Es gibt keine strengen Kriterien für die Überprüfung der Inokulumkonzentration mit Koloniezahlen. Koloniezählungen kann zunächst für jede getestete und / oder in regelmäßigen Abständen, um den Verdünnungsschritt in Schritt 4.2 durchgeführt zu validieren Arten überprüft werden. Es ist wichtig, dass die Gültigkeit des 0,5 McFarland Standard wird auch routinemäßig mit E. geprüft coli ATCC 25922 mit einem Verfahren ähnlich wie in Schritt 4.5. Wenn die Ergebnisse nicht gleichwertig sind 1-2 x 10 8 KBE / ml, ein neuer 0,5-McFarland-Standard sollte erhalten werden. Wenn die Koloniezählungen von MIC Vertiefungen außerhalb des akzeptablen Bereichs (2-8 × 10 5 CFU / ml und MIC-Ergebnisse für die klinische Isolat (e) variieren von the erwarteten Normalverteilung (z. 0,03 bis 0,12 ug / ml für S. aureus) und / oder MIC-Ergebnisse für die Qualitätskontrolle Isolat (n) außerhalb des erwarteten Bereiche ist Validierungstests notwendig und Verfahren Änderung gerechtfertigt sein. Es wird vorgeschlagen, dass eine validierte 0,5 McFarland-Standard verwendet, um die Koloniezahl (n) zu wiederholen und wenn die Ergebnisse wieder außerhalb der erwarteten Ergebnisse sollte das Inokulum Verdünnung wie in Schritt 4.2 durchgeführt entsprechend angepasst werden, und die MIC wiederholt. Beachten Sie, dass eine Reinheitskontrolle ist notwendig, auch wenn eine Koloniezahl wird durchgeführt, weil die Koloniezahl Prozedur verwendet eine verdünnte Volumen, das nicht unbedingt niedrigere Konzentrationen von kontaminierenden Organismen erkennen kann.
Für eine MIC-Test als gültig betrachtet werden, müssen akzeptablen Wachstum in der Wachstumskontrolle erfolgen. Für die meisten Bakterien, die gegen Dalbavancin getestet werden (dh., Staphylokokken, Streptokokken und Enterokokken, Wachstum wird als Schaltfläche (in der Regel> 2 mm) und weniger fr gesehen werdenequently kann das Wachstum als Trübung in der gut angezeigt. Im Gegensatz zu einigen antimikrobiellen Mitteln, die zeigen können nachlaufende Wirkung wie Konzentrationen zu erhöhen, werden Dalbavancin Endpunkte in der Regel gut definiert. Es gibt verschiedene Betrachtungsvorrichtungen vorgesehen, um das Lesen microdilution Tests zu erleichtern, die verwendet werden, um Dalbavancin enthaltenden Platten, solange es keinen Kompromiss in der Fähigkeit, das Wachstum in den Vertiefungen zu erkennen gelesen werden kann.
Die kritischen Schritte im Rahmen des Protokolls sind die Teile des Verfahrens, das zur Löslichkeit Dalbavancin und Zugabe von P80 verbunden sind verwandt. Wichtig ist, daß die maximale Konzentration des Dalbavancin verwendet nicht größer ist als 1,600 & mgr; g / ml, dass DMSO als Lösungsmittel, bevor die Brühe Verdünnungen verwendet wird und daß Zwischenkonzentrationen werden in DMSO hergestellt, daß die Endkonzentration von DMSO in dem MIC Platte Vertiefungen nicht größer ist als 1%. DMSO ist hygroskopisch und daher der Einsatz von älteren Flaschen DMSO war consideratIonen hinsichtlich Dalbavancin Löslichkeit. Doch während ein kleiner BMD-Studie mit Qualitätskontrollstämme hat gezeigt, nicht auf eine wichtige Variable sein (siehe Ergebnisteil), ist es gute Praxis, um neue oder kürzlich eröffnete Flaschen DMSO zu verwenden. Es ist auch wichtig, dass P80 ist mit der Brühe in dem letzten Schritt des Arzneimittelverdünnung Herstellung zugesetzt und in einer Endkonzentration von 0,002% in der MIC gut.
Die BMD-Verfahren, die hier verwendet Vorbereitung der MIC-Panels mit 50 ul / Vertiefung in Dalbavancin und P-80-Konzentrationen zweimal die endgültige Konzentration und Zugabe von Impfgut mit 50 ul / Vertiefung, so dass Endvolumen / Vertiefung 100 ul. Dieses Verfahren ermöglicht eine MIC Tafelformat für das Testen von sowohl S. hergestellt werden aureus und S. pneumoniae weil die lysiertem Pferdeblut kann das Inokulum hinzugefügt. Alternative Methoden zur Herstellung von MIC Platten mit 100 ul / Vertiefung unter Zusatz von bis zu 10 ul / Vertiefung in der beschriebenenCLSI und ISO-Verfahren.
Die Dalbavancin anfällig Haltepunkt für S. aureus ist ≤0.12 ug / ml (FDA Packungsbeilage). Wie es in den letzten Überwachungs gezeigt, sind die Mehrzahl der Isolate Dalbavancin in Konzentrationen von 0,06 ug / ml 15 gehemmt. Mit einem anfälligen Haltepunkt in der Nähe des modalen MIC kann jede Variation MIC infolge Verfahren Unterschiede Suszeptibilität Raten auswirken. Da der BMD Verfahren für Dalbavancin enthält einige einzigartige Schritte (genauer gesagt, die Verwendung von DMSO in Vorbereitung der Lager und Zwischenwirkstoffverdünnungen und 0,002% P80 in der MIC gut, ist es unerlässlich, dass das Verfahren genau befolgt werden. Die S. aureus QC Organismus (ATCC 29213) mit einer sehr klaren Dalbavancin modalen MIC von 0,06 ug / ml, ist ein guter Indikator für die Verfahrensvariante und sollte routinemäßig verwendet, um die BMD Methode zu bestätigen. Wenn MIC Ergebnisse werden mit dem erwarteten Bereich von 0,03-0,12 g / ml, sind aber tendiert entweder an den niedrigen oder high Seite dieses Bereichs liegt, wird eine weitere Validierung der Methode gerechtfertigt.
Die Zugabe von 0,002% P80 wird für alle relevanten grampositive Organismen empfohlen (staphylococcci, Enterokokken und Streptokokken.) Es ist jedoch bemerkenswert, dass es wurde gezeigt, dass Pferdeblut lysiert wirkt ähnlich wie P-80, bezogen auf seine Anti-Bindungs Fähigkeit und daß die Zugabe von P-80 bis + CAMHB LHB keinen zusätzlichen Effekt auf Dalbavancin Streptokokken MIC-Ergebnisse.
Es gibt derzeit keine Plattendiffusionsverfahren zum Testen Dalbavancin und wegen der schlechten Korrelation von BMD und AD Ergebnisse, Empfindlichkeitsprüfung von Dalbavancin mit dem AD-Verfahren wird nicht empfohlen, 12, 14. Der BMD-Methode sollte für die Zukunft Einschätzung Dalbavancin Anfälligkeit verwendet werden und als Goldstandard für die Entwicklung der kommerziellen antimikrobielle Empfindlichkeitstests.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.
Materials
| Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
| Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
| Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
| Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
| Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
| 12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) | VistaLab | Brewster, NY | |
| 96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
| 50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16x125mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 12x17mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16 mL centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
| Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
| Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
| Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
| Incubator (ambient) | Sanyo | ||
| Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
| Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
| Lab coats |
References
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