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Immunology and Infection

Une méthode de référence de microdilution de bouillon pour dalbavancine<em> In Vitro</em> Tests de sensibilité des bactéries qui se développent Aerobically

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53028
, ,
1Laboratory Specialists, Inc, 2Clinical Microbiology, Actavis plc

Summary

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Abstract

Antibiogramme (AST) est effectué pour évaluer l'activité in vitro des agents antimicrobiens contre diverses bactéries. Les résultats de l'AST, qui sont exprimées en concentrations minimales inhibitrices (CMI) sont utilisés dans la recherche pour le développement antimicrobien et suivi du développement de la résistance et dans le cadre clinique pour des conseils de traitement antimicrobien. Dalbavancine est un agent antimicrobien lipoglycopeptidique semi-synthétique qui a été approuvé mai 2014 par la Food and Drug Administration (FDA) pour le traitement des infections de la peau et des structures cutanées bactériennes aiguës causées par des organismes Gram-positifs. L'avantage de dalbavancine sur les thérapies anti-staphylocoques actuelles est sa longue demi-vie, ce qui permet un dosage une fois par semaine. Dalbavancine a une activité contre Staphylococcus aureus (y compris à la fois sensible à la méthicilline S. aureus [SASM] et résistant à la méthicilline S. aureus [SARM]), staphylocoques à coagulase négative, <em> Streptococcus pneumoniae, groupe Streptococcus anginosus, β-hémolytique streptocoques et de la vancomycine entérocoques sensibles. Semblable à d'autres agents de lipoglycopeptidique récents, optimisation des méthodes de test de sensibilité CLSI et le bouillon ISO comprend l'utilisation de diméthylsulfoxyde (DMSO) comme solvant lors de la préparation des solutions d'achat d'actions et de polysorbate 80 (P80) pour soulager l'adhésion de l'agent au plastique. Avant les études cliniques et pendant le développement initial de la dalbavancine, des études de sensibilité sont effectués à l'aide de P-80 et les résultats de CMI ont tendance à être 2-4 fois plus élevée et de même supérieur MIC résultats ont été obtenus avec la méthode de dilution de sensibilité agar. Dalbavancine a été inclus dans CLSI microdilution tables de méthodologie en 2005 et modifiée en 2006 afin de clarifier l'utilisation de DMSO et P-80. Le microdilution de bouillon (DMO) de procédure illustrée ici est spécifique à dalbavancine et est en conformité avec les méthodes du CLSI et ISO, avec des détails et foc étape par étapenous sur les étapes critiques ajouté pour plus de clarté.

Introduction

Dalbavancine est un lipoglycopeptidique semi-synthétique qui a été approuvé par la FDA mai 2014 pour le traitement des infections de la peau et des structures cutanées bactériennes aiguës causées par des organismes Gram-positifs 1. L'objectif principal de cette méthode en détail dans un format vidéo est de fournir des orientations claires aux scientifiques de laboratoire clinique et de recherche pour les essais et la déclaration des résultats précis et reproductibles dalbavancine susceptibilité.

La détermination d'un agent antimicrobien MIC par des méthodes commerciales est systématiquement effectuée dans les laboratoires cliniques pour l'évaluation in vitro de l'activité d'un agent contre les bactéries pathogènes. La méthode décrite ici est la méthode de microdilution de bouillon tel que recommandé par le CLSI et ISO 2,3,4. Depuis dalbavancine méthodes de susceptibilité commerciales ne sont pas actuellement disponibles (au moment de cette publication) et la diffusion du disque et les méthodes de dilution agar ne sont pas actuellement recommandé fou dalbavancine, méthodes bouillon de référence de dilution sont les options actuelles disponibles 12,14. Comme cette méthode de référence est pas un commercial et approuvé par la FDA méthode de diagnostic in vitro, les laboratoires cliniques aux Etats-Unis qui utilisent cette procédure pour les tests du patient doit se conformer à des exigences réglementaires pour un test développé en laboratoire (LDT). Il est prévu que l'utilisation dalbavancine augmente, plus les laboratoires auront un besoin de tester ce composé. Tests vancomycine comme un substitut pour la détermination de la susceptibilité de S. dalbavancine aureus a été validé 5. Cependant, dalbavancine peut être actif contre la vancomycine S. intermédiaire aureus (VISA) et, par conséquent, les cliniciens peuvent demander les résultats dalbavancine MIC. En outre, les résultats de CMI pour d'autres espèces bactériennes peuvent être demandés.

Le point d'arrêt sensible de la FDA pour la dalbavancine contre S. aureus a été établi à ≤0.12 pg / ml. FDA attribué seulement un suscepticatégorie ble en raison du manque de données sur les isolats résistants. La distribution de MIC normale chez type sauvage S. aureus est entre de 0,03 à 0,12 pg / ml, avec un micro modale claire de 0,06 pg / ml. Une légère variation dans les résultats de CMI en raison de la méthode de différence, en plus de la variation de la DMO inhérente de ± une dilution, pourrait avoir un impact significatif sur les taux de susceptibilité. 6 similaires à d'autres agents lipoglycopeptidique, des tests de sensibilité de dalbavancine peut être difficile en raison solubilité et de la taille relativement importante de la molécule et ses propriétés de liaison 7,8,9. La méthode de référence BMD décrite ici comprend deux étapes spécifiques qui sont uniques aux agents insolubles et / ou des agents de lipoglycopeptidique: (1) l'utilisation de DMSO pour la préparation de solutions d'achat d'actions et (2) plus de 0,002% de P-80 dans le panneau de MIC finale Des dilutions. L'objectif de cette publication vidéo est de fournir la clarté à l'dalbavancine méthode DMO et specifically concentrer sur ces étapes clés, pour assurer des résultats précis et reproductibles MIC.

Protocol

REMARQUE: Se reporter aux documents du CLSI M7-A10 et M100-S25 et / ou ISO / FDIS 20776-1 pour tous les détails de la méthode de référence de microdilution de bouillon pour antibiogramme 2, 3, 4 Les méthodes de référence permettent options dans une partie de la. des procédures spécifiques à la préparation de l'inoculum et panneau de MIC production pour atteindre le même résultat final. Le procédé détaillé ici se rapporte à un agent antimicrobien, dalbavancine, et certaines des étapes représentent une de plusieurs manières potentiellement le procédé de référence peut être fait. Mesures de sécurité appropriées (compatibles avec le niveau de biosécurité 2) devraient être utilisés 10. Le format de panneau MIC utilisé aux fins de la présente publication vidéo est montrée dans le tableau 1. 1. Conserver dalbavancine poudre Dès réception de diagnostic poudre de dalbavancine de qualité, conserver à -20 ° C dans un environnement desséché dans un congélateur non-dégivrant. Avant l'utilisation, la poudre devrait équilibrer àatteindre la TA avant l'ouverture. 2. Préparer des dilutions panneau MIC Préparer une solution stock pas supérieure à 1600 ng / ml de dalbavancine dans soignée DMSO (pur) dans des tubes en verre ou en plastique stériles, et d'utiliser le même jour de préparation ou de conserver à -20 à -60 o C ou moins pour une utilisation future dans un congélateur non-dégivrant. Prendre en considération la puissance de dalbavancine comme prévu sur la documentation reçue avec la poudre, lors de la pesée de la poudre (voir l'équation 1 par exemple 800 pg / ml préparation de la pâte). Diluer le stock dilution semblable au régime comme il est indiqué dans la colonne 1 ("de concentration de la source") dans le tableau 2 avec du DMSO pur dans des tubes en verre ou en plastique stériles. Utilisez une pipette pour mesurer diluant et une autre pipette pour ajouter le dalbavancine stock initial au premier tube. Pour chaque concentration dalbavancine boursier ultérieure utiliser une nouvelle pipette. Préparer 100X finale concent du panneau de MICdilutions de rationnement (concentrations intermédiaires) avec du DMSO pur. Comme on le voit dans les colonnes 2-4 du tableau 2, mélanger des volumes appropriés de source et DMSO pour atteindre concentration intermédiaire souhaité (volumes à utiliser dépendra du nombre de panneaux de MIC à faire). Préparer 0,004% P80: Préparer une solution de travail fraîchement stock de 2% P80 par addition de 0,1 ml à 4,9 ml P80 dH 2 O. Stériliser par passage à travers une solution de filtre de 0,22 micron et de l'utilisation le jour même de la préparation. Préparer 0,004% P80 diluant en faisant une dilution 1: 500 de 2% P80 (par exemple, 0,3 ml de 2% de P80 149,7 ml de CAMHB). Diluer davantage les concentrations intermédiaires préparés à l'étape 2.2 1: 100 à cation ajusté Mueller Hinton Broth (CAMHB) additionné de 0,004% (v / v) de polysorbate-80 (P-80) P-80 et / ou LHB (pour les streptocoques) ajouté au double de la concentration finale car l'addition de l'inoculum (étape 4.3) se traduira par une dilution de 1: 2. Voir les colonnes 6 et 7 du tableau 2 </stRong>. 3. Préparer panneaux MIC Distribuer 50 pi de chaque solution de dalbavancine préparé à l'étape 2.3 dans les puits appropriés du panneau de MIC et inclure des médias seulement dans un puits (de contrôle de la croissance bien). Une pipette multi-canaux avec embouts stériles peut être utilisé pour cette étape. Utilisez panneaux immédiatement ou sceller avec du film plastique, dans des sacs en plastique et le placer immédiatement dans un congélateur non-dégivrant à ≤-20 ° C (de préférence à ≤-60 ° C) jusqu'à ce que nécessaire. Si les panneaux sont utilisés gelés, enlever les joints et placer des panneaux individuels sur la paillasse pendant 15-30 min (jusqu'à ce que le contenu et sont décongelées) avant de procéder à l'inoculation panneau. 4. Inoculer panneaux MIC, Effectuer Pureté et Colony Setup comte Sélectionnez plusieurs colonies bien isolées à partir d'une gélose au sang 18-24 h ou autre plaque de gélose non sélective. Touchez le haut de chaque colonie avec une anse stérile ou un tampon et le transfert à 1-5 ml CAMHB ou saline jusqu'à ce que la turbidité est équivalent à un standard McFarland 0,5. Évaluer la turbidité par comparaison visuelle de la 0,5 McFarland ou avec un appareil de mesure photométrique. De 15 à 30 min de préparation, diluer l'inoculum à 1: 100 dans CAMHB (100 ul dans 10 ml CAMHB). Pour la plupart des bactéries testées contre dalbavancine, à l'exception de S. pneumoniae, cette dilution fournira une concentration de puits finale de 5 x 10 5 UFC / ml (fourchette acceptable est 2-8 x 10 5 UFC / ml). Pour S. pneumoniae, la concentration bactérienne basée sur la comparaison de la turbidité à un 0,5 McFarland est généralement beaucoup moins, donc, diluer l'inoculum 1:25 (400 pi dans 10 ml CAMHB + 10% + LHB). Dans les 15 min après la préparation de l'inoculum, transférer 50 pi de l'inoculum final dans chaque puits (à l'exception du contrôle de la stérilité ainsi) du panneau MIC préparé à l'étape 3. Une pipette multi-canal à l'aide des conseils stériles peut être utilisé pour cette étape. Effectuez une vérification de la puretépar le transfert et la diffusion d'une aliquote de 1-10 ul de la commande de croissance positive et en utilisant une boucle stérile à une gélose non sélective (par exemple, gélose trypticase soja avec du sang de mouton à 5%). Configuration comptage des colonies en supprimant 10 ul du contrôle de la croissance et avec une pipette à canal unique et pointe stérile et transfert à 10 ml de solution saline (1: 1000 dilution). Mélanger et transférer 100 pi avec une pipette à canal unique et pointe stérile pour un milieu approprié, non sélectif agar (par exemple, gélose trypticase soja avec du sang de mouton à 5%) et répartis sur toute la surface de la gélose avec une boucle stérile, en répétant deux fois dans des directions différentes pour assurer une distribution uniforme de l'inoculum (dilution 1:10). 5. Les panneaux Incuber MIC, Colony comte et la pureté Plaques Sceller chaque panneau MIC ou une pile de pas plus de 4 panneaux dans un sac plastique, avec du ruban en plastique ou avec un couvercle en plastique hermétique avant l'incubation. Sinon, placez vide panneau de MIC sur le top de pile de pas plus de 4 panneaux de MIC, placez une serviette en papier humide dans un récipient en plastique, panneaux lieu de MIC dans le récipient en plastique et fermer le récipient avec le couvercle. Incuber panneaux MIC dans un incubateur de l'air ambiant à 35 ° C ± 2 ° C pendant 16-20 heures (staphylocoques et les entérocoques) et 20-24 h (streptocoques) à 30 min de l'inoculation. Incuber le comptage des colonies et plaques de pureté dans les mêmes conditions à l'exception des streptocoques incuber dans un incubateur à CO2 à 5%. 6. Lisez le MIC et Colony Count plaques; Vérifiez Pureté Plate Lire la MIC comme la concentration la plus faible qui inhibe totalement la croissance bactérienne dans les puits comme détecté par l'oeil nu. Compter les colonies sur la plaque de comptage des colonies. Multiplier chaque colonie par facteur de dilution (1: 10 000) (par exemple, 50 colonies est équivalent à 5 x 10 5 CFU / ml). Une plage acceptable est de 20-80 colonies (2-8 x 10 5 UFC / ml) et est utilisé comme un Approdirectrice ximate. Vérifiez plaque de pureté. Si toutes les colonies sont similaires aux colonies utilisés dans l'étape 4.1, l'inoculum peut être considéré comme pur. Si il ya d'autres colonies présentes, puis il ya le potentiel pour un contaminant d'être présent dans le panneau de MIC et le test doit être répété. 7. vérifier les résultats de contrôle de qualité. Reportez-vous au tableau 3 pour les gammes attendues de CLSI souches de contrôle de qualité. Signaler Seulement résultats de l'essai isolats si les résultats MIC pour dalbavancine organisme (s) de contrôle de la qualité sont dans la fourchette attendue. Si une CMI ≥0.25 pg / ml est obtenue pour tout S. clinique aureus isoler, répéter les tests dalbavancine MIC et / ou envoyer à un laboratoire de référence pour la vérification.

Representative Results

MIC méthodes standardisées sont nécessaires afin de suivre le développement de la résistance, un objectif important de divers programmes de surveillance antimicrobiens. Résultats dalbavancine MIC pour isolats collectés en Europe et aux USA en 2011-2013 étaient <0,25 ng / ml pour 99,9% des S. aureus et 100% des streptocoques (tableau 4). Pour évaluer l'importance de l'utilisation de frais (scellé) DMSO, triple test des CMI dalbavancine de la DMO pour QC souches de S. ATCC 29213 aureus et E. faecalis ATCC 29212 et dupliquer les tests pour S. pneumoniae ATCC 49619 a été réalisée en utilisant (1) DMSO à partir ampoules scellées, (2) DMSO à partir d'une bouteille de 1 L qui était au sein de la date d'expiration et avait été utilisée précédemment pour 2 ans et (3) une aliquote de DMSO de la même 1 L bouteille (échantillon 2) qui a été autorisé à s'asseoir dans un bêcher ouvert pendant 72 heures avant de les utiliser. Résultats de la MIC dalbavancine utilisant des panneaux fabriqués avec trois échantillons de DMSO étaient similaires et wans le QC gammes acceptables (tableau 5). La perte d'activité de dalbavancine suite d'une exposition de la solution d'achat d'actions au plastique et sans l'ajout de P-80 a été bien documenté 7. Dans 2 des études supplémentaires, l'addition de P-80 et les solutions mères initiales et intermédiaires (tableau 6) et l'utilisation de tubes en verre ou en plastique pour la préparation des solutions initiales et intermédiaires sous licence (tableau 7) n'a pas eu d'effet sur les résultats dalbavancine MIC. Il y avait aussi pas d'effet sur ​​les résultats de MIC dalbavancine quand polypropylène et le polystyrène plaques provenant de trois fabricants ont été utilisés (tableau 7). La présence de sang de cheval lysé dans les milieux de bouillon pour les essais de streptocoques a été démontré qu'ils ont une activité de surfactant analogue, comparable à P-80 7, 8. La méthode de référence de la dalbavancine pour le streptocoque ne comprend à la fois cheval sang de P-80 et lysées ,Cependant, à la différence des staphylocoques et des entérocoques, des résultats dalbavancine MIC pour les streptocoques sont similaires (à +/- une dilution) avec et sans addition de P-80. Comme cela a été présenté précédemment et représenté sur la figure 1, la dalbavancine dilution de gélose (AD) CMI sont généralement 2-8 fois plus élevée par rapport à la référence de courant DMO 12, 13, 14. Contrairement DMO, l'addition de 0,002% de P-80 ne affecter AD dalbavancine résulte MIC 12. Équation 1: Exemple de dalbavancine Stock Solution Préparation étapes de préparation de 25 ml de 800 pg / ml de solution dalbavancine.. Figure 1. Comparaison des dalbavancine et vancomycine DMO à AD. Résultats de l'étude qui a comparé dalbavancin et la vancomycine DMO et AD MIC résultats pour sélectionner les isolats bactériens Gram-positif. Moyenne (A) dalbavancine et (B) à la vancomycine microdilution en bouillon et gélose Dilution MIC résultats en ng / ml pour 15 Staphylococcus aureus, 8 à coagulase négative staphylocoques (SNC), 5 Enterococcus faecalis et 14 streptocoques (groupes A, B et C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 UN DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL; 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 0,5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. B DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 0,5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. C DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL0,12 DAL 0,25 DAL 0,5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. RÉ DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 0,5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. E DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 </td> DAL 0,5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. F DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 0,5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. G DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. H DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 0,5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. DAL Dalbavancine <td> Les concentrations sont exprimés en ng / ml après 50 pl / puits inoculation Tableau 1. MIC Plate Format. Le format de plaque à 96 puits, montrant l'emplacement de dilutions de dalbavancine et puits de contrôle positif utilisé comme un exemple dans cette publication vidéo 1 2 3 4 5 6 7 8 Conc Source. (ug / ml) Source Volume (ml) DMSO Volume (ml) Intermédiaire Conc. dans du DMSO (ug / ml) Volume intermédiaire Conc. (ml) Volume CAMHB + 0,004% P80 * (ml) 2X Conc. Après dilution 1: 100 dans CAMHB (ug / ml) Conc final du groupe spécial. Après l'inoculation (ug / ml) 800 10 10 400 0,02 1,98 4 2 400 0,5 0,5 200 0,02 1,98 2 1 400 0,5 1.5 100 0,02 1,98 1 0,5 400 0,5 3.5 50 0,02 1,98 0,5 0,25 50 0,5 0,5 25 0,02 1,98 0,25 0,125 50 0,5 1.5 12,5 0,02 1,98 0,125 0,06 50 0,5 3.5 6,25 0,02 1,98 0,06 0,03 6,25 0,5 </ td> 0,5 3.13 0,02 1,98 0,03 0,015 6,25 0,5 1.5 1.5 0,02 1,98 0,015 0,008 6,25 0,5 3.5 0,8 0,02 1,98 0,008 0,004 0,8 0,5 0,5 0,4 0,02 1,98 0,004 0,002 Ce tableau a été modifié depuis CLSI M100-S25, Tableau 8B 3 Tableau 2. Schéma pour la préparation des dilutions d'agents antimicrobiens insolubles dans l'eau pour être utilisé dans un bouillon Testing dilutions sensibilité. Les volumes de dalbavancine solutions de travail et diluants pour la préparation de MIC finaledalbavancine solutions de 0,002 à 2 pg / ml. La souche de contrôle de qualité Prévue dalbavancine MIC (pg / ml) S. aureus ATCC 29213 De 0,03 à 0,12 E. faecalis ATCC 29212 De 0,03 à 0,12 S. pneumoniae ATCC 49619 De 0,008 à 0,03 Tableau 3. Résultats attendus dalbavancine CMI pour les souches de contrôle de qualité 3, 11 CLSI résultats. De contrôle de qualité pour les souches proposées à tester avec des isolats cliniques afin de vérifier la méthodologie appropriée Tableau 4. Répartition des dalbavancine Résultats MIC (Nombre à chaque MIC) des Etats-Unis et européen 2011-2013 Surveillance d'études 15. Résultats dalbavancine MIC d'une étude publiée de récents isolats cliniques comme un indicateur de la dalbavancine actuel de l'activité in vitro. Isoler # Dalbavancine CMI (ug / ml) DMSO 1 DMSO 2 DMSO 3 S. aureus ATCC 29213 0,12 0,06 0,06 0,12 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 E. faecalis ATCC 29212 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 <em> S. pneumoniae ATCC 49619 0,015 0,015 0,015 0,03 0,015 0,015 DMSO 1 = flamme Unopened scellé 10 ml ampoules DMSO 2 = Foire ouvert bouteille 1L DMSO 3 = Foire ouvert bouteille 1L – assis sur un banc dans le bécher à découvert pendant 72 heures Tableau 5. dalbavancine MIC Résultats (pg / ml) en utilisant DMSO Stock et Intermédiaire dilutions Préparation avec du DMSO à partir de 3 sources. Les résultats d'une étude de MIC dalbavancine qui a comparé l'effet de l'utilisation de différents solvants de DMSO dans la préparation du dalbavancine stock et dilutions intermédiaires. Isoler Nombre Répliquer Nombre Dalbavancine CMI (ug / ml) Dalb w / P80 dans du DMSO Dalb w / o P80 dans le DMSO S. aureus ATCC 29213 1 0,06 0,06 2 0,06 0,06 3 0,06 0,06 4 0,06 0,06 S. aureus clinique DP80-002SA 1 0,03 0,03 S. aureus ATCC 700699 1 0,5 0,5 S. pneumoniae ATCC 49619 1 0,03 0,015 2 0,03 0,015 3 0,03 0,015 4 0,03 0,015 S. pyogenes cliniques: DP80-004PY 1 0,015 0,015 DP80-005PY 1 0,03 0,03 DP80-006PY 1 0,03 0,015 DP80-007PY 1 0,06 0,03 DP80-008PY 1 0,03 0,015 S. agalactiae clinique: DP80-009AG 1 0,06 0,12 DP80-010AG 1 0,06 0,03 DP80-011AG 1 0,06 0,06 DP80-012AG 1 0,06 0,06 S. dysgalactiae Clinical DP80-013DY 1 0,03 0,03 S. pneumoniae clinique: DP80-014SP 1 0,06 0,06 DP80-015SP 1 0,03 0,03 DP80-016SP 1 0,03 0,03 DP80-017SP 1 0,06 0,06 Tableau 6. Résultats dalbavancine MIC utilisant DMSO Stock et Intermédiaire dilutions Préparation avec et sans 0,002% P-80. Les résultats d'une étude de MIC dalbavancine qui a comparé l'effet de l'ajout de 0,002% P-80 à dalbavancine stock et dilutions intermédiaires. Isoler Répliquer Nombre </td> Stock dilution Tubes Microplaque (plastique de type) Poly-propylène, Greiner Polystyrène Verre Plastique 1h plastique 1h Plastique / Intermédiaire 1h Greiner Corning Nunc S. aureus ATCC 29213 1 0,06 0,03 0,03 0,03 0,06 0,03 0,06 0,03 2 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,06 3 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 E. faecalis ATCC 29212 <td> 1 0,06 0,06 0,06 0,06 0,03 0,03 0,06 0,03 2 0,06 0,06 0,06 0,06 0,03 0,03 0,06 0,03 3 0,06 0,06 0,06 0,06 0,03 0,03 0,06 0,03 S. pneumoniae ATCC 49619 1 0,015 0,015 0,015 0,015 0,008 0,008 0,008 0,008 2 0,015 0,015 0,015 0,015 0,008 0,015 0,008 0,008 Verre = Stock initial fait en bouteille de verre, utilisée immédiatement pour faire concentration intermédiaires dans des tubes en plastique, immédiatement utilisés pour faire des dilutions de bouillon. Stock Plastique = initiale faite en tube de centrifugeuse en plastique, utilisé immédiatement pour faire concentrations intermédiaires dans des tubes en plastique, utilisés immédiatement pour faire des dilutions de bouillon. 1 h plastique = Stock initial fait dans le tube de centrifugeuse en plastique, laisser reposer sur le banc pendant 1 heure puis utilisé pour fabriquer des concentrations intermédiaires dans des tubes en plastique, utilisés immédiatement pour faire concentrations dans le bouillon. Plastique 1 h / Intermédiaire 1 hr = Stock initial fait dans le tube de centrifugeuse en plastique, laisser reposer sur le banc pendant 1 heure puis utilisé pour fabriquer des concentrations intermédiaires dans des tubes en plastique, laisser reposer sur le banc pendant 1 heure puis utilisé pour fabriquer des concentrations dans le bouillon. Tableau 7. Résultats dalbavancine MIC à l'aide Stock dilutions Préparation en plastique et en verre Tubes et MIC types de plastique de la plaque. Résultats ofa dalbavancine étude MIC qui a comparé l'effet de l'utilisation de tubes de plastique ou de verre lors de la préparation des solutions mères et également l'effet de l'utilisation de différentes sources et les types de plastique pour des plaques de microtitrage.

Discussion

Les détails de procédé suivantes sont présentées pour des considérations supplémentaires lors de la préparation pour le test dalbavancine MIC. La conception du panneau de MIC dépend du nombre d'agents antimicrobiens à tester (par exemple., Dalbavancine seul ou de multiples agents) et les espèces de bactéries à tester. Les concentrations de dalbavancine devraient englober les points d'arrêt d'interprétation pour toutes les espèces bactériennes à tester et toute la gamme des dilutions attendues pour au moins une souche QC. La série de dilutions antimicrobien peut être organisé soit en lignes ou en colonnes en fonction du nombre d'agents antimicrobiens et / ou des isolats / plaque et la méthode d'inoculation. Le volume de poudre de dalbavancine et le bouillon doit être calculé pour assurer que des quantités optimales sont produits et des déchets est minime. Pour l'exemple utilisé dans cette publication, les volumes sont basés sur la préparation de deux panneaux MIC. Cation ajusté bouillon de Mueller Hinton devrait être préparée et autoclavée selon l'hommeles instructions et la stérilité des médias données par le fabricant vérifiées. MIC panneaux peuvent être fabriqués et utilisés le jour même de la préparation ou ils peuvent être testés avec les organismes de contrôle de qualité appropriés et les panneaux validées conservés congelés pour une utilisation future. Il est important d'utiliser des techniques stériles pendant toute la procédure.

Il n'y a pas de critères stricts pour la vérification de la concentration de l'inoculum avec le nombre de colonies. Les numérations des colonies peuvent être vérifiées pour chaque espèce initialement testé et / ou périodiquement à valider l'étape de dilution effectuée à l'étape 4.2. Il est important que la validité de la norme McFarland 0,5 est également vérifiée régulièrement avec E. ATCC 25922 coli en utilisant une procédure similaire à l'étape 4.5. Si les résultats ne sont pas équivalents à 1-2 x 10 8 UFC / ml, une nouvelle norme McFarland 0,5 doit être obtenue. Si les comptes de colonies de puits de MIC sont en dehors de la plage acceptable (2-8 x 10 5 résultats UFC / ml et MIC pour l'isolat (s) clinique varient d'ee attendue distribution normale (par ex. de 0,03 à 0,12 ug / ml pour S. aureus) et / ou résultats de CMI pour isolat de contrôle de la qualité (s) sont à l'extérieur des limites attendues, les tests de validation est nécessaire et la méthode de modification peut être justifiée. Il est suggéré qu'un standard McFarland 0,5 validé est utilisé pour répéter le décompte (s) de la colonie et si les résultats sont à nouveau en dehors des résultats escomptés, la dilution de l'inoculum comme effectuée à l'étape 4.2 devrait être ajusté en conséquence et le MIC répété. Notez qu'une vérification de la pureté est nécessaire même si un nombre de colonies est effectuée parce que la procédure de comptage des colonies utilise un volume dilué qui peuvent ne pas détecter nécessairement plus faibles concentrations d'organismes contaminants.

Pour un test MIC soit considéré comme valide, la croissance acceptable doit se produire dans le contrôle de la croissance ainsi. Pour la plupart des bactéries qui seront testés contre dalbavancine (ie., Les staphylocoques, les streptocoques et les entérocoques, la croissance seront considérés comme un bouton (typiquement> 2 mm) et moins frequently, la croissance peut apparaître comme la turbidité dans le puits. Contrairement à certains agents antimicrobiens qui peuvent présenter de fuite effet que les concentrations augmentent, critères d'dalbavancine sont généralement bien définis. Il existe divers dispositifs de visualisation destinés à faciliter la lecture des tests de microdilution, qui peuvent être utilisés pour lire des plaques contenant de dalbavancine tant qu'il n'y a pas de compromis dans la capacité de discerner la croissance dans les puits.

Les étapes critiques dans le protocole sont liées aux parties de la procédure qui sont liés à la solubilité de la dalbavancine et addition de P80. Il est important que la concentration maximale de la dalbavancine utilisé est non supérieure à 1600 pg / ml, que le DMSO est utilisé comme solvant et que des concentrations intermédiaires sont préparés dans du DMSO avant d'effectuer des dilutions en bouillon de sorte que la concentration finale de DMSO dans le MIC panneau puits ne dépasse pas 1%. Le DMSO est hygroscopique et par conséquent, l'utilisation de bouteilles âgés de DMSO était une EXAMENions à l'égard de la dalbavancine solubilité. Cependant, alors que d'une petite étude de la DMO avec des souches de contrôle de qualité a montré que ce ne soit pas une variable importante (voir la section Résultats), il est recommandé d'utiliser de nouvelles ou récemment ouverts bouteilles de DMSO. Il est également important que P80 est ajoutée au bouillon à l'étape finale de préparation et de dilution de médicament est à une concentration finale de 0,002% dans la MIC bien.

Le mode opératoire décrit ici utilise DMO préparation de panneaux de MIC en utilisant 50 pl / puits à la dalbavancine et P-80 concentrations de deux fois la concentration finale d'inoculum et avec addition de 50 pl / puits de sorte que le volume final est / puits 100 ul. Cette méthode permet à un format de panneau MIC à être produite pour l'essai de deux S. aureus et S. pneumoniae car le sang de cheval lysé peut être ajouté à l'inoculum. D'autres procédés pour la préparation de panneaux de MIC en utilisant 100 pl / puits avec addition d'un maximum de 10 ul / puits sont décrits dans laProcédures CLSI et ISO.

Le dalbavancine arrêt susceptible pour S. aureus est ≤0.12 pg / ml (FDA package insert). Comme cela est représenté sur la surveillance récent, la plupart des isolats sont inhibées par la dalbavancine à des niveaux de 0,06 ug / ml 15. Avec un point d'arrêt sensibles à proximité de la MIC modale, toute variation de MIC en raison des différences de méthode peut influer sur les taux de susceptibilité. Parce que la procédure de la DMO pour dalbavancine comprend certaines mesures uniques (en particulier, l'utilisation de DMSO dans la préparation de stock et des dilutions de médicaments intermédiaires et 0,002% P80 dans le MIC bien, il est impératif que la méthode est suivie à la lettre. Le S. aureus QC organisme (ATCC 29213) avec un très clair MIC de 0,06 pg / ml dalbavancine modale, a été un bon indicateur de la méthode variation et doit être utilisé systématiquement pour valider la méthode DMO. Si les résultats sont MIC avec la gamme de 0,03 à 0,12 attendu ug / ml, mais sont orientés soit à la basse ou HIGh côté de cette gamme, outre la validation de la méthode est justifiée.

L'addition de 0,002% P80 est recommandé pour tous les Gram positif pertinente organismes (staphylococcci, entérocoques et streptocoques). Cependant, il est à noter qu'il a été démontré que lysée sang de cheval actes similaires à P-80 par rapport à son anti-liaison capacité et que l'addition de P-80 à + CAMHB LHB n'a aucun effet supplémentaire sur la dalbavancine streptocoques résultats de CMI.

Il n'y a actuellement aucune méthode de diffusion de disques pour les tests dalbavancine et en raison de la faible corrélation de la DMO et des résultats de AD, tests de sensibilité de dalbavancine en utilisant la méthode de AD est déconseillé 12, 14. La méthode la DMO doit être utilisé pour l'évaluation future de dalbavancine susceptibilité et comme une norme d'or pour le développement de tests de sensibilité aux antimicrobiens commerciales.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

Materials

Dalbavancin Metrics, Inc. Greenville, NC BI-397
Vancomycin Sigma-Aldrich St. Louis, MO C5793
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth Becton Dickinson Sparks, MD 212322
Lysed horse blood Cleveland Scientific Bath, OH
Dose-it peristaltic pump Integra Biosciences Hudson, NH
Multi-channel pipet (Viaflo II) Integra Hudson, NH 4164
12 channel pipet (Matrix) ThermoFisher Scientific Waltham, MA
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) VistaLab Brewster, NY
96 well microplate Greiner Bio-one Monroe, NC 650161
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
16x125mm disposable glass tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
12x17mm snap cap, polystyrene tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
16 mL centrifuge tubes BioExpress Kaysville, UT C-3394-2
Reagent reservoirs Integra Biosciences Hudson, NH 4312
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) Biologix Lenexa, KA 65-0001,65-0010
Tryptic soy agar + 5% sheep blood Becton Dickinson Sparks, MD
Incubator (ambient) Sanyo
Incubator (5% CO2) Sanyo
Analytical balance  ThermoFisher Scientific Waltham, MA
Gloves Kimberly-Clark 52817
Lab coats
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References

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Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. J. Vis. Exp. (103), e53028, doi:10.3791/53028 (2015).
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