مرجع مرق الطريقة Microdilution لDalbavancin<em> في المختبر</em> حساسية اختبار من البكتيريا التي تنمو هوائيا
Summary
Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.
Abstract
يتم إجراء اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات (AST) لتقييم النشاط في المختبر من العوامل المضادة للجراثيم ضد البكتيريا المختلفة. وتستخدم النتائج AST، والتي يتم التعبير عنها تركيزات المثبطة الدنيا (البلدان المتوسطة الدخل) في مجال البحوث للتنمية المضادة للميكروبات ورصد تطور المقاومة والإعداد السريرية لتوجيه العلاج المضادة للميكروبات. Dalbavancin هو عامل lipoglycopeptide شبه الاصطناعية المضادة للميكروبات التي وافق مايو 2014 من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) لعلاج الجلد وبنية الجلد الالتهابات البكتيرية الحادة التي تسببها الكائنات موجبة الجرام. ميزة dalbavancin على العلاجات المضادة للالعنقوديات الحالية لنصف العمر الطويل، والذي يسمح لجرعات مرة واحدة أسبوعيا. Dalbavancin ديه نشاط ضد المكورات العنقودية الذهبية (بما في ذلك مثسلين عرضة S. الذهبية [MSSA] ومقاومة للميثيسيلين S. الذهبية [MRSA])، المخثرة سلبية المكورات العنقودية، <em> العقدية الرئوية، العقدية مجموعة ذبحية، β-الانحلالي العقديات المكورة المعوية وعرضة. على غرار غيرها من العوامل lipoglycopeptide مؤخرا، والتحسين من CLSI وISO مرق طرق اختبار قابلية يشمل ذلك استخدام سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) كمذيب عند إعداد الحلول الأسهم وبوليسوربات 80 (P80) للتخفيف من حدة تمسك وكيل لمن البلاستيك. قبل الدراسات السريرية وخلال التطوير الأولي للdalbavancin، لم تجر دراسات قابلية مع استخدام P-80 و تميل النتائج MIC أن يكون تم الحصول عليها 2-4 العالي أضعاف، وبالمثل أعلى MIC النتائج مع أجار طريقة التخفيف الحساسية. وكان أول شملت Dalbavancin في CLSI مرق microdilution الجداول منهجية في عام 2005 والمعدل في عام 2006 لتوضيح استخدام DMSO وP-80. وmicrodilution مرق (BMD) الإجراء المبين هنا هو محدد لdalbavancin ويتفق مع الأساليب CLSI وISO، مع خطوة بخطوة بالتفصيل وFOCلنا على خطوات حاسمة وأضاف لوضوح.
Introduction
Dalbavancin هو lipoglycopeptide شبه الاصطناعية التي وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير مايو 2014 لعلاج الجلد وبنية الجلد الالتهابات البكتيرية الحادة التي تسببها الكائنات إيجابية الجرام 1. الهدف الأساسي من تفاصيل هذه الطريقة في شكل شريط فيديو هو توفير توجيهات واضحة إلى المختبر والبحوث السريرية العلماء لاختبار النتائج والإبلاغ عنها dalbavancin قابلية دقيقة وقابلة للتكرار.
يتم تنفيذ تقرير لعامل مضاد للميكروبات MIC بالطرق التجارية بشكل روتيني في مختبرات السريرية لتقييم النشاط في المختبر وكيلا ضد البكتيريا المسببة للأمراض. الطريقة الموصوفة هنا هو طريقة microdilution مرق على النحو الموصى به من قبل CLSI وISO 2،3،4. منذ dalbavancin طرق قابلية التجارية غير متوفرة حاليا (في ذلك الوقت من هذا المنشور) ونشر القرص وطرق التخفيف آغار لا ينصح حاليا وأو dalbavancin وطرق مرق إشارة تخفيف هي الخيارات المتاحة حاليا 12،14. وبما أن هذه الطريقة المرجعية ليست التجاري وFDA مسح الأسلوب في المختبر التشخيصي، والمختبرات السريرية في الولايات المتحدة الأمريكية أن استخدام هذا الإجراء لاختبار المريض يجب أن تلتزم بالمتطلبات التنظيمية لمختبر المتقدمة اختبار (LDT). ومن المتوقع أن كما يزيد استخدام dalbavancin، والمزيد من مختبرات سوف يكون هناك حاجة لاختبار هذا المركب. فانكومايسين اختبار كبديل لتحديد dalbavancin قابلية S. تم التحقق من صحة الذهبية 5. ومع ذلك، قد يكون dalbavancin فعال ضد فانكومايسين وسيط S. الذهبية (فيزا)، وبالتالي، الأطباء أن يطلبوا النتائج dalbavancin MIC. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يطلب النتائج MIC الأنواع البكتيرية الأخرى.
وتوقف عرضة FDA لdalbavancin ضد S. وقد أنشئت الذهبية في ≤0.12 ميكروغرام / مل. ادارة الاغذية والعقاقير المخصصة فقط susceptiفئة بلي بسبب عدم وجود بيانات على العزلات مقاومة. توزيع MIC الطبيعي بين النوع البري S. الذهبية يعزل ما بين 0،03-0،12 ميكروغرام / مل، مع MIC مشروط واضح من 0.06 ميكروغرام / مل. وهناك اختلاف طفيف في نتائج MIC نتيجة لأسلوب الفرق، بالإضافة إلى الاختلاف BMD المتأصل في ± واحد التخفيف، ويحتمل أن يكون لها تأثير كبير على معدلات الحساسية. 6 مماثلة إلى وكلاء lipoglycopeptide أخرى، يمكن أن dalbavancin اختبار الحساسية تكون صعبة نتيجة ل من الذوبان وحجم كبير نسبيا من جزيء وخصائص ملزمة لها 7،8،9. طريقة إشارة BMD هو موضح هنا تضم اثنين من الخطوات المحددة التي هي فريدة من نوعها لعملاء غير قابلة للذوبان و / أو وكلاء lipoglycopeptide: (1) استخدام DMSO لإعداد الحلول الأسهم و(2) إضافة-P 80 0.002٪ في لوحة MIC النهائية التخفيفات. والهدف من هذا المنشور الفيديو هو توفير الوضوح على dalbavancin طريقة BMD وspecificaالتركيز LLY على هذه الخطوات الرئيسية، لضمان النتائج MIC دقيقة وقابلة للتكرار.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم عرض تفاصيل الطريقة التالية لاعتبارات إضافية عند التحضير للاختبار dalbavancin MIC. سوف تصميم لوحة MIC يعتمد على عدد من العوامل المضادة للجراثيم لفحصها (أي.، dalbavancin وحده أو وكلاء متعددة) وأنواع من البكتيريا لفحصها. وينبغي أن تشمل تركيزات dalbavancin نقاط الإيقاف التفسيرية لجميع الأنواع البكتيرية لفحصها ومجموعة كاملة من التخفيفات المتوقع لسلالة واحدة على الأقل QC. يمكن تنظيم سلسلة تخفيف مضادات الميكروبات سواء في الصفوف أو الأعمدة اعتمادا على عدد من العوامل المضادة للجراثيم و / أو يعزل / لوحة وطريقة التلقيح. يجب أن يحسب حجم مسحوق dalbavancin والمرق للتأكد من أن كميات الأمثل ويتم إنتاج والنفايات هو الحد الأدنى. للمثال المستخدمة في هذا المنشور، وتقوم وحدات التخزين على إعداد فريقي هيئة التصنيع العسكري. وينبغي إعداد الموجبة تعديل مولر هينتون مرق وتعقيمها وفقا للإنسانالتحقق تعليمات ufacturer والعقم وسائل الإعلام. لوحات هيئة التصنيع العسكري يمكن أن تكون وتستخدم في نفس اليوم من إعداد أو أنها يمكن اختبارها مع الكائنات مراقبة الجودة المناسبة والألواح التحقق من صحة تخزينها في المجمد لاستخدامها في المستقبل. من المهم أن استخدام تقنيات معقمة في جميع أنحاء الداخلي.
ليس هناك معايير صارمة للتحقق من تركيز اللقاح مع التهم مستعمرة. يمكن مراجعة التهم مستعمرة في البداية لكل أنواع اختبار و / أو دوريا للتحقق من صحة الخطوة تخفيف يؤديها في الخطوة 4.2. من المهم أن صلاحية مكفارلاند مستوى 0.5 محددا أيضا بشكل روتيني مع E. القولونية ATCC 25922 باستخدام إجراء مماثل إلى الخطوة 4.5. إذا لم تكن النتائج تعادل 1-2 × 10 8 كفو / مل، يجب الحصول على الجديد 0.5 مكفارلاند القياسية. إذا كانت التهم مستعمرة من الآبار MIC هي خارج نطاق مقبول (2-8 × 10 5 خلية / مل النتائج وهيئة التصنيع العسكري لعزل السريرية (ق) تختلف من عشريتوقع ه التوزيع الطبيعي (على سبيل المثال. 0،03-0،12 ميكروغرام / مل للبكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) و / أو نتائج هيئة التصنيع العسكري لمراقبة الجودة عزل (ق) هي خارج النطاقات المتوقعة، اختبار التحقق من صحة ضروري ويمكن أن يكون له ما يبرره طريقة التعديل. ويقترح أن التحقق من صحة 0.5 مكفارلاند معيار يستخدم لتكرار العد مستعمرة (ق) وإذا كانت النتائج غير مرة أخرى خارج النتائج المتوقعة، وتخفيف اللقاح كما يؤديها في الخطوة 4.2 يجب أن تعدل وفقا لذلك وتكرار MIC. لاحظ أن الاختيار نقاء ضروري حتى لو يتم تنفيذ عدد مستعمرة لإجراء تعداد المستعمرة يستخدم حجم المخففة التي قد لا يكشف بالضرورة تركيزات أقل من الكائنات تلوث.
لاختبار هيئة التصنيع العسكري أن تعتبر صالحة، يجب أن يحدث نمو مقبول في مراقبة النمو بشكل جيد. بالنسبة لمعظم البكتيريا التي سيتم اختبارها ضد dalbavancin (أي.، المكورات العنقودية، المكورات العقدية والمكورات المعوية، سوف ينظر النمو كزر (عادة> 2 مم) وأقل الابequently، قد تظهر النمو كما التعكر في البئر. وخلافا لبعض العوامل المضادة للجراثيم التي قد تظهر زائدة اعتبارا زيادة تركيزات، تعرف النهاية dalbavancin عادة بشكل جيد. هناك العديد من أجهزة العرض يهدف إلى تسهيل اختبارات القراءة microdilution، والتي يمكن استخدامها لقراءة dalbavancin تحتوي على لوحات طالما لا يوجد حل وسط في القدرة على التمييز النمو في الآبار.
ترتبط الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول للمراحل الإجراءات التي تتعلق ذوبان dalbavancin وإضافة P80. من المهم أن الحد الأقصى لتركيز dalbavancin المستخدم هو لا يزيد عن 1600 ميكروغرام / مل، ويستخدم هذا DMSO كمادة مذيبة وتعد أن تركيزات المتوسطة في DMSO قبل اتخاذ التخفيفات مرق بحيث التركيز النهائي من DMSO في MIC لوحة الآبار ليس أكبر من 1٪. DMSO هو بلوري ولذا، فإن استخدام الزجاجات القديمة من DMSO لconsideratايون فيما يتعلق dalbavancin الذوبان. ومع ذلك، في حين أظهرت دراسة BMD صغيرة مع سلالات مراقبة الجودة هذا لا يجب أن يكون متغير مهم (انظر القسم النتائج)، ومن الممارسات الجيدة لاستخدام زجاجات جديدة أو فتح مؤخرا من DMSO. ومن المهم أيضا أن P80 يضاف إلى المرق في الخطوة الأخيرة من الإعداد تخفيف المخدرات وغير بتركيز نهائي من 0.002٪ في MIC جيدا.
الإجراء BMD المضمنة هنا يستخدم إعداد لوحات MIC باستخدام 50 ميكرولتر / جيد في dalbavancin وP-80 تركيزات مرتين على التركيز النهائي وإضافة اللقاح مع 50 ميكرولتر / جيد بحيث الحجم النهائي / هو من 100 ميكرولتر. يسمح هذا الأسلوب للتنسيق لوحة واحدة MIC إلى أن يتم إنتاجها لاختبار كلا S. الذهبية وS. الرئوية لأنه لا يمكن أن تضاف الحصان الدم هي lysed إلى اللقاح. طرق بديلة لإعداد لوحات MIC باستخدام 100 ميكرولتر / جيد مع إضافة ما يصل إلى 10 ميكرولتر / جيد موصوفة فيCLSI وISO الإجراءات.
وتوقف عرضة dalbavancin لS. العنقودية الذهبية هي ≤0.12 ميكروغرام / مل (FDA حزمة إدراج). كما هو مبين في المراقبة الأخيرة، وتحول دون غالبية العزلات التي كتبها dalbavancin عند مستويات 0.06 ميكروغرام / مل 15. مع نقطة توقف عرضة بالقرب من MIC مشروط، أي الاختلاف في هيئة التصنيع العسكري نتيجة للاختلافات طريقة يمكن أن تؤثر على معدلات الحساسية. لأن الإجراء BMD لdalbavancin يتضمن بعض الخطوات فريدة من نوعها (على وجه التحديد، واستخدام DMSO في إعداد الأوراق المالية والتخفيفات المخدرات وسيطة و 0.002٪ P80 في MIC جيدا، فمن الضروري أن يتبع طريقة بالضبط. الكائن S. الذهبية QC (آي تي سي سي 29213) مع واضحة جدا MIC dalbavancin مشروط من 0.06 ميكروغرام / مل، فقد كان مؤشرا جيدا على طريقة الاختلاف وينبغي أن تستخدم بشكل روتيني للتحقق من صحة طريقة BMD. إذا كانت النتائج هي هيئة التصنيع العسكري مع النطاق المتوقع من 0،03-0،12 ميكروغرام / مل، ولكن تتجه إما إلى انخفاض أو المهزومةح جانب من هذا النطاق، يوجد ما يبرر مواصلة التحقق من صحة هذه الطريقة.
يوصى بإضافة 0.002٪ P80 لجميع الكائنات موجبة الجرام ذات الصلة (staphylococcci، المكورات المعوية، والمكورات العقدية). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه قد ثبت أن هي lysed حصان الدم يعمل على غرار P-80 بالنسبة لسياستها المعادية ملزم القدرة وأن إضافة P-80 إلى CAMHB + LHB لا يوجد لديه تأثير إضافي على dalbavancin العقديات النتائج هيئة التصنيع العسكري.
لا يوجد حاليا أي طريقة نشر القرص لاختبار dalbavancin وبسبب الارتباط الضعيف لBMD والنتائج AD، اختبار الحساسية من dalbavancin باستخدام طريقة AD لا ينصح 12، 14. طريقة BMD ينبغي أن تستخدم لتقييم المستقبل dalbavancin الحساسية وكمعيار الذهب للتنمية التجارية اختبارات الحساسية المضادة للميكروبات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.
Materials
| Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
| Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
| Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
| Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
| Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
| 12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) | VistaLab | Brewster, NY | |
| 96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
| 50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16x125mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 12x17mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16 mL centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
| Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
| Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
| Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
| Incubator (ambient) | Sanyo | ||
| Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
| Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
| Lab coats |
References
- Boucher, H. W., et al. Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection. The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).
- . . M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).
- . . M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).
- . Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO/FDIS. 20776-1, (2006).
- Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin. Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).
- Turnidge, J., Paterson, D. L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).
- Rennie, R. P., et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent. Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).
- Arhin, F. F., et al. Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing. Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).
- Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies. Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).
- Ribbon Panel, B. l. u. e. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).
- Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity. Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).
- Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132. ASM. , (2012).
- Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms. Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).
- Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).
- Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012). Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).
