JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Referentie Bouillon microverdunningsplaten Methode voor dalbavancin<em> In Vitro</em> Gevoeligheid testen van Bacteriën die aNBAO Grow

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53028
, ,
1Laboratory Specialists, Inc, 2Clinical Microbiology, Actavis plc

Summary

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Abstract

Antimicrobiële gevoeligheidstests (AST) wordt uitgevoerd om de in vitro activiteit van antimicrobiële middelen tegen verschillende bacteriën beoordelen. De AST resultaten die worden uitgedrukt als minimale remmende concentraties (MIC's) worden gebruikt in onderzoek naar antimicrobiële ontwikkeling en monitoring van resistentieontwikkeling en in de klinische setting voor antimicrobiële therapie begeleiding. Dalbavancin is een semi-synthetisch lipoglycopeptide antimicrobieel middel dat mei 2014 door de Food and Drug Administration (FDA) werd goedgekeurd voor de behandeling van acute bacteriële huid en de huid structuur infecties veroorzaakt door Gram-positieve organismen. Het voordeel van dalbavancin dan huidige anti-stafylokokken therapieën zijn lange halfwaardetijd, die zorgt voor eenmaal per week dosering. Dalbavancin heeft activiteit tegen Staphylococcus aureus (zowel methicilline-gevoelige S. aureus [MSSA] en methicilline-resistente S. aureus [MRSA]), coagulase-negatieve stafylokokken, <em> Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus groep, β-hemolytische streptokokken en vancomycine gevoelig enterokokken. Net als andere recente lipoglycopeptide middelen, optimalisering van CLSI en ISO bouillon gevoeligheid testmethoden omvat het gebruik van dimethylsulfoxide (DMSO) als oplosmiddel bij de voorbereiding voorraadoplossingen en polysorbaat 80 (P80) om hechting van het middel aan plastic verlichten. Vóór de klinische studies en tijdens de initiële ontwikkeling van dalbavancin werden gevoeligheid studies niet uitgevoerd met gebruik van P-80 en MIC resultaten neiging om 2-4 maal hoger en eveneens hogere MIC resultaten werden verkregen met de agar verdunning gevoeligheid methode. Dalbavancin werd voor het eerst opgenomen in CLSI bouillon microverdunningsplaten methodologie tafels in 2005 en gewijzigd in 2006 om het gebruik van DMSO en P-80 te verduidelijken. De brij microdilutie (BMD) die hier wordt getoond is specifiek voor dalbavancin en conform de CLSI en ISO-methoden, stap voor stap detail en focons op de kritische stappen toegevoegd voor de duidelijkheid.

Introduction

Dalbavancin is een semi-synthetisch lipoglycopeptide die door de FDA goedgekeurd in mei 2014 voor de behandeling van acute bacteriële huid en huidstructuur infecties veroorzaakt door Gram-positieve organismen 1. Het primaire doel van detaillering van deze methode in een video-formaat is om duidelijke richtlijnen te verstrekken aan de klinische laboratoria en onderzoekers voor het testen en rapportage van nauwkeurige en reproduceerbare dalbavancin gevoeligheid resultaten.

De bepaling van een antimicrobieel middel MIC door commerciële methoden wordt routinematig uitgevoerd in klinische laboratoria voor de beoordeling van de in vitro activiteit van een agent tegen pathogene bacteriën. De hier beschreven methode is de brij microverdunningsplaten werkwijze zoals door CLSI en ISO 2,3,4. Sinds dalbavancin commerciële gevoeligheid methoden zijn momenteel niet beschikbaar (op het moment van deze publicatie) en verspreiding schijf en agar verdunning methoden worden momenteel afgeraden fof dalbavancin verwijzing bouillon verdunning methoden zijn de huidige mogelijkheden 12,14. Aangezien deze referentie methode is niet een commercieel en FDA goedgekeurd in vitro diagnostische methode, klinische laboratoria in de Verenigde Staten die deze procedure voor het testen van de patiënt kunnen gebruiken, moet zich houden aan de wettelijke vereisten voor een laboratorium ontwikkelde toets (LDT). Verwacht wordt dat de dalbavancin gebruik toeneemt, zal laboratoria behoefte om deze verbinding te testen. Vancomycine tests als een surrogaat voor het bepalen van dalbavancin gevoeligheid van S. aureus is gevalideerd 5. Evenwel dalbavancin actief tegen vancomycine tussenproduct S. zijn aureus (VISA) en daarom kunnen clinici dalbavancin MIC resultaten te vragen. Bovendien kunnen MIC resultaten van andere bacteriële soorten worden aangevraagd.

De FDA gevoelig breekpunt voor dalbavancin tegen S. aureus is vastgesteld op ≤0.12 ug / ml. FDA toegewezen slechts een susceptible categorie vanwege het gebrek aan gegevens over resistente isolaten. De normale MIC verdeling wild type S. aureus isolaten tussen 0,03-0,12 ug / ml, namelijk modale MIC van 0,06 ug / ml. Een lichte variatie in MIC gevolg methode verschil naast de inherente BMD variatie van ± een verdunning zou kunnen hebben een aanzienlijke invloed op de gevoeligheid tarieven. 6 vergelijkbaar met andere lipoglycopeptide middelen kunnen dalbavancin gevoeligheidstest uitdagend als resultaat oplosbaarheid en de relatief grote omvang van het molecuul en de bindingseigenschappen 7,8,9. De referentie BMD hier beschreven methode omvat twee specifieke stappen die uniek oplosbare middelen en / of lipoglycopeptide middelen zijn: (1) het gebruik van DMSO voor de bereiding van voorraadoplossingen en (2) toevoeging van 0,002% P-80 in de finale MIC panel verdunningen. Het doel van deze video publicatie is om duidelijkheid te verschaffen aan de dalbavancin BMD-methode en specifically richten op deze belangrijke stappen, om nauwkeurige en reproduceerbare MIC resultaten te verzekeren.

Protocol

Opmerking: Raadpleeg CLSI documenten M7-A10 en M100-S25 en / of ISO / FDIS 20776-1 voor de volledige details van de referentie-bouillon microverdunningsplaten methode voor antimicrobiële gevoeligheid 2, 3, 4 De referentiemethoden zorgen voor opties in een aantal van de. procedures die specifiek zijn voor inoculum voorbereiding en MIC panel productielijn om hetzelfde eindresultaat te bereiken. De methode die hier beschreven heeft betrekking op een antimicrobieel middel, dalbavancin en sommige stappen één van potentieel verschillende manieren de referentiemethode kan vertegenwoordigen. Gepaste veiligheidsmaatregelen (in overeenstemming met bioveiligheid niveau 2) moeten worden benut 10. De MIC paneelformaat gebruikt voor het doel van deze videopublicatie wordt weergegeven in tabel 1. 1. Store dalbavancin Poeder Na ontvangst van diagnostische kwaliteit dalbavancin poeder, bewaar bij -20 ° C in een gedroogde omgeving in een niet ontdooien diepvriezer. Voorafgaand aan gebruik moet het poeder in evenwicht komenbereiken RT voor opening. 2. Bereid MIC Panel verdunningen Bereid een voorraadoplossing niet hoger dan 1600 ug / ml dalbavancin in keurige (zuiver) DMSO in steriele glazen of plastic buizen en gebruik op dezelfde dag van de bereiding of opslag bij -20 tot -60 ° C of lager voor toekomstig gebruik in een niet ontdooien diepvriezer. Rekening houden met de potentie van dalbavancin zoals voorzien op het ontvangen met het poeder documentatie, bij het ​​afwegen van het poeder (zie vergelijking 1 bijvoorbeeld 800 ug / ml voorraad voorbereiding). Verdun de verwatering vergelijkbaar met het schema zoals weergegeven in kolom 1 ("Source Concentration") in tabel 2 met nette DMSO in steriele glazen of plastic buizen. Gebruik een pipet voor het meten van verdunner en andere pipet voor het toevoegen van de eerste dalbavancin bouillon aan de eerste buis. Voor elke volgende dalbavancin voorraad concentratie gebruik maken van een nieuwe pipet. Bereid 100X finale MIC panel concentrantsoen verdunningen (tussenliggende concentraties) met nette DMSO. Zoals wordt getoond in de kolommen 2-4 van Tabel 2, samen voldoende hoeveelheden van de bron en DMSO gewenste tussenstand concentratie bereikt (volumes te gebruiken zal afhangen van het aantal MIC panelen worden gemaakt). Bereid 0,004% P80: Bereid een verse werkvoorraad oplossing van 2% P80 door het toevoegen van 0,1 ml P80 tot 4,9 ml dH 2 O. Steriliseren door het passeren door een 0,22 micron filter en gebruiksoplossing op dezelfde dag van de bereiding. Bereid 0,004% P80 verdunningsmiddel door een 1: 500 verdunning van 2% P80 (bijvoorbeeld 0,3 ml van 2% P80 tot 149,7 ml CAMHB). Verdun de tussenliggende concentraties bereid in Stap 2,2 1: 100 in kation aangepast Mueller Hinton bouillon (CAMHB) aangevuld met 0,004% (v / v) polysorbaat-80 (P-80) P-80 en / of LHB (voor streptokokken) toegevoegd dubbel zo eindconcentratie vanwege toevoeging van inoculum (stap 4,3) zal resulteren in een 1: 2 verdunning. Zie kolommen 6 en 7 in tabel 2 </strong>. 3. Bereid MIC Panelen Doseer 50 pi van elke dalbavancin oplossing bereid in stap 2.3 in geschikte putjes van de MIC-paneel en omvatten media slechts in een goed (groei controle ook). Een multi-channel pipet met steriele tips kunnen worden gebruikt voor deze stap. Gebruik panelen direct of zegel met plastic folie, plaats in plastic zakken en onmiddellijk plaats in een niet-ontdooien vriezer bij ≤-20 ° C (bij voorkeur ≤-60 ° C) totdat het nodig is. Indien bevroren panelen worden gebruikt, verwijder afdichtingen en plaats afzonderlijke panelen op de labtafel 15-30 min (tot ver inhoud ontdooid) alvorens tot panel inenting. 4. Inoculeren MIC Panelen Voer Zuiverheid en Setup kiemgetal Selecteer meerdere goed geïsoleerde kolonies van een 18-24 uur agar of andere niet-selectieve agarplaat. Raak de bovenkant van elke kolonie met een steriele lus of doekje en overdracht naar 1-5 ml CAMHB of sAline totdat troebelheid is equivalent aan een 0,5 McFarland standaard. Beoordelen van troebelheid door visuele vergelijking met de 0,5 McFarland of fotometrische inrichting. Binnen 15-30 minuten van de voorbereiding, verdunnen het inoculum 1: 100 in CAMHB (100 pi in 10 ml CAMHB). Voor de meeste bacteriën getest op dalbavancin, behalve S. pneumoniae, zal deze verdunning een uiteindelijke goed concentratie van 5 x 10 5 CFU / ml (acceptabel bereik is 2-8 x 10 5 CFU / ml) te verstrekken. Voor S. pneumoniae, bacteriële concentratie op basis van vergelijking van troebelheid van een 0,5 McFarland typisch aanzienlijk minder, dan verdunnen 1:25 inoculum (400 ul in 10 ml CAMHB + 10% + LHB). Binnen 15 min na inoculum bereiding overdracht 50 ul van het uiteindelijke inoculum aan elk putje (met uitzondering van de steriliteit controlewell) de MIC panel bereid in stap 3. Een multi-channel pipet met steriele tips kunnen worden gebruikt voor deze stap. Voer een zuiverheid chequedoor de overdracht en de verspreiding van een 1-10 ul monster van de positieve groei controle goed met een steriele lus om een niet-selectieve agar (bv trypticasesoja agar met 5% schapen bloed). Setup kiemgetal door het verwijderen van 10 ul van de groei controle goed met een enkel kanaal pipet en steriel tip en transfer naar 10 ml zoutoplossing (1: 1000 verdunning). Mengen en overdracht 100 ul met een enkel kanaal pipet en steriel tip om een geschikte, niet-selectieve agar medium (bijv trypticasesoja agar met 5% schapen bloed) en verspreid over het hele agar oppervlak met een steriele lus, herhalen twee keer in verschillende richtingen gelijkmatige verdeling van het inoculum (1:10 verdunning) te verzekeren. 5. Incubate MIC Panelen, kiemgetal en Zuiverheid Platen Verzegelen elke MIC paneel of stapel niet meer dan 4 panelen in een plastic zak, met plastic tape of met een strakke plastic hoes vóór incubatie. Als alternatief, plaats lege MIC paneel op de t-op van de stapel niet meer dan 4 MIC panelen, plaats een vochtige papieren handdoek in een plastic container, plaats MIC panelen in de plastic container en sluiten container veilig met deksel. Incubeer MIC panelen in een lucht incubator bij 35 ° C ± 2 ° C gedurende 16-20 uur (stafylokokken en enterokokken) en 20-24 uur (streptokokken) binnen 30 min inoculatie. Incubeer de telling kolonie en zuiverheid platen onder dezelfde omstandigheden behalve Incubate streptokokken in een 5% CO 2 incubator. 6. Lees het MIC en de Kolonie Count platen; Controleer Zuiverheid Plate Lees de MIC de laagste concentratie die volledig remt bacteriegroei in de putjes zoals gedetecteerd door het blote oog. Tellen kolonies op de kolonie kiemgetal. Vermenigvuldig elke kolonie verdunningsfactor (1: 10.000) (bijvoorbeeld 50 kolonies gelijk aan 5 x 10 5 CFU / ml). Een aanvaardbare bereik 20-80 kolonies (2-8 x 10 5 CFU / ml) en wordt gebruikt als voorkomendximate richtlijn. Controleer zuiverheid plaat. Als alle kolonies zijn vergelijkbaar met de kolonies die in stap 4,1, dan kan het inoculum worden zuiver beschouwd. Als er andere kolonies aanwezig, dan is er potentieel een verontreiniging aanwezig in het MIC paneel en de test moet herhaald worden. 7. Controleer Quality Control resultaten. Zie Tabel 3 voor de verwachte bereik van CLSI kwaliteitscontrole stammen. Alleen rapporteren resultaten van de test isolaten als dalbavancin MIC resultaten voor kwaliteitscontrole organisme (s) zijn binnen het verwachte bereik. Als een MIC van ≥0.25 ug / ml wordt verkregen op elke klinische S. aureus isoleren, herhalen de dalbavancin MIC testen en / of naar een referentielaboratorium voor verificatie.

Representative Results

Gestandaardiseerde MIC methoden nodig om resistentie, een belangrijke doelstelling van verscheidene antimicrobiële bewakingsprogramma's controleren. Dalbavancin MIC resultaten voor isolaten in Europa en de VS geïnd 2011-2013 waren <0,25 g / ml voor 99,9% van S.aureus en 100% van streptokokken (Tabel 4). Om het belang van het gebruik van verse (verzegeld) DMSO, drievoud testen van dalbavancin BMD MICs voor QC stammen S. beoordelen aureus ATCC 29213 en E. faecalis ATCC 29.212 en dubbele tests voor S. pneumoniae ATCC 49619 werd uitgevoerd onder toepassing van (1) DMSO uit verzegelde ampullen, (2) DMSO uit een 1 L fles die was op de vervaldatum en werden vroeger voor 2 jaar en (3) een hoeveelheid van DMSO uit dezelfde 1 L bottle (monster 2) dat liet zitten in een open beker gedurende 72 uur voor gebruik. Dalbavancin MIC resultaten met behulp van panelen met drie DMSO monsters waren vergelijkbaar en winnen de aanvaardbare QC bereik (Tabel 5). Het verlies van dalbavancin activiteit na blootstelling van de voorraadoplossing kunststof en zonder de toevoeging van P-80 is goed gedocumenteerd 7. In 2 aanvullende studies, de toevoeging van P-80 van de basis- en intermediaire voorraadoplossingen (tabel 6) en het gebruik van glas of plastic buizen voor de bereiding van de eerste en tussengelegen voorraadoplossingen (Tabel 7) had geen effect op de dalbavancin MIC resultaten. Er was ook geen effect op dalbavancin MIC resultaten bij polypropeen en polystyreen platen drie fabrikanten gebruikt (Tabel 7). De aanwezigheid van gelyseerd paarden bloed in de bouillon media voor het testen van streptokokken is aangetoond dat een surfactant-achtige activiteit, vergelijkbaar met P-80 7, 8 hebben. De dalbavancin referentiemethode voor streptococcus heeft zowel P-80 en gelyseerd paardenbloed omvatten ,In tegenstelling stafylokokken en enterokokken, dalbavancin MIC resultaten voor streptokokken vergelijkbaar (binnen +/- 1 verdunning) met en zonder de toevoeging van P-80. Zoals eerder voorgesteld en getoond in figuur 1, dalbavancin agar verdunning (AD) MIC typisch 2-8 maal hoger in vergelijking met de huidige BMD referentie 12, 13, 14. Anders BMD, toevoeging van 0,002% P-80 niet invloed dalbavancin AD MIC resultaten 12. Vergelijking 1: Voorbeeld van dalbavancin Stock Solution Voorbereiding Voorbereiding stappen voor 25 ml van 800 ug / ml dalbavancin oplossing.. Figuur 1. Vergelijking van dalbavancin en Vancomycine BMD naar AD. De resultaten van de studie die dalbava vergelijkingncin en vancomycine BMD en AD MIC resultaten voor bepaalde Gram-positieve bacteriële isolaten. Gemiddelde (A) dalbavancin en (B) Vancomycine Broth microdilutie en Agar Verdunning MIC-resultaten in mg / ml voor 15 Staphylococcus aureus, 8 coagulasepositieve negatieve stafylokokken (CNS), 5 Enterococcus faecalis en 14 streptokokken (groepen A, B en C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 EEN DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL; 0.06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. B DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. C DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL0.12 DAL 0,25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. D DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. E DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 </td> DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. F DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. G DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 00,5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. H DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0,015 Dal 0,03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0,25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. DAL Dalbavancin <td> De concentraties worden vermeld in ug / ml na 50 gl / putje inoculatie Tabel 1. MIC Plate formaat. De 96 well plaat formaat met de locatie van dalbavancin verdunningen en de positieve controle putten als voorbeeld gebruikt in deze video publicatie 1 2 3 4 5 6 7 8 Source Conc. (ug / ml) Volume Source (ml) Volume DMSO (ml) Intermediate Conc. in DMSO (ug / ml) Volume Intermediate Conc. (ml) Volume CAMHB + 0,004% P80 * (ml) 2X Conc. Na 1: 100 verdunning in CAMHB (ug / ml) Final Panel Conc. Na inoculatie (ug / ml) 800 1.0 1.0 400 0.02 1.98 4 2 400 0.5 0.5 200 0.02 1.98 2 1 400 0.5 1.5 100 0.02 1.98 1 0.5 400 0.5 3.5 50 0.02 1.98 0.5 0.25 50 0.5 0.5 25 0.02 1.98 0.25 0,125 50 0.5 1.5 12.5 0.02 1.98 0,125 0.06 50 0.5 3.5 6.25 0.02 1.98 0.06 0.03 6.25 0,5 </ td> 0.5 3.13 0.02 1.98 0.03 0,015 6.25 0.5 1.5 1.5 0.02 1.98 0,015 0,008 6.25 0.5 3.5 0.8 0.02 1.98 0,008 0,004 0.8 0.5 0.5 0.4 0.02 1.98 0,004 0,002 Deze tabel is gewijzigd van CLSI M100-S25, Tabel 8B 3 Tabel 2. schema voor het bereiden verdunningen van water onoplosbare Antimicrobial Agents worden gebruikt in Bouillon Verdunningen gevoeligheid testen. De volumes van dalbavancin werkende oplossingen en verdunners voor de voorbereiding van de definitieve MICdalbavancin oplossingen van 0,002-2 mg / ml. Kwaliteitscontrole Strain Verwacht dalbavancin MIC (ug / ml) S. aureus ATCC 29213 0,03-0,12 E. faecalis ATCC 29.212 0,03-0,12 S. pneumoniae ATCC 49619 0,008-0,03 Tabel 3. Verwachte dalbavancin MIC Resultaten voor Quality Control Stammen 3, 11. CLSI kwaliteitscontrole resultaten voorgesteld stammen te testen, samen met klinische isolaten om een goede methodologie te controleren Tabel 4. Verdeling van dalbavancin MIC Resultaten (Aantal bij elke MIC) uit de VS en de Europese 2011-2013 Surveillkomstig Study 15. Dalbavancin MIC resultaten van een gepubliceerde studie van recente klinische isolaten als aanwijzing voor de huidige dalbavancin in vitro activiteit. Isoleren # Dalbavancin MIC (ug / ml) DMSO 1 DMSO 2 DMSO 3 S. aureus ATCC 29213 0.12 0.06 0.06 0.12 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 E. faecalis ATCC 29.212 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 <em> S. pneumoniae ATCC 49.619 0,015 0,015 0,015 0.03 0,015 0,015 DMSO 1 = Ongeopende vlam verzegelde 10 ml ampullen DMSO 2 = vaak geopend 1L fles DMSO 3 = Veel geopend 1L fles – zat op een bankje in ongedekte beker voor 72 uur Tabel 5. dalbavancin MIC Resultaten (ug / ml) met behulp van DMSO Stock en Intermediate verdunningen Voorbereiding met DMSO van 3 Sources. De resultaten van een studie die dalbavancin MIC effect van het gebruik van verschillende oplosmiddelen DMSO ter voorbereiding van de dalbavancin voorraad en intermediaire verdunningen vergeleken. Isoleer Aantal Repliceren Aantal Dalbavancin MIC (ug / ml) DALB w / P80 in DMSO DALB w / o P80 in DMSO S. aureus ATCC 29213 1 0.06 0.06 2 0.06 0.06 3 0.06 0.06 4 0.06 0.06 S. aureus klinische DP80-002SA 1 0.03 0.03 S. aureus ATCC 700.699 1 0.5 0.5 S. pneumoniae ATCC 49619 1 0.03 0,015 2 0.03 0,015 3 0.03 0,015 4 0.03 0,015 S. pyogenes klinisch: DP80-004PY 1 0,015 0,015 DP80-005PY 1 0.03 0.03 DP80-006PY 1 0.03 0,015 DP80-007PY 1 0.06 0.03 DP80-008PY 1 0.03 0,015 S. agalactiae klinische: DP80-009AG 1 0.06 0.12 DP80-010AG 1 0.06 0.03 DP80-011AG 1 0.06 0.06 DP80-012AG 1 0.06 0.06 S. dysgalactiae Clinical DP80-013DY 1 0.03 0.03 S. pneumoniae klinisch: DP80-014SP 1 0.06 0.06 DP80-015SP 1 0.03 0.03 DP80-016SP 1 0.03 0.03 DP80-017SP 1 0.06 0.06 Tabel 6. dalbavancin MIC resultaten met behulp van DMSO Stock en Intermediate Verdunningen Voorbereiding met en zonder 0,002% P-80. De resultaten van een studie die dalbavancin MIC effect van het toevoegen van 0,002% P-80 te dalbavancin voorraad en intermediaire verdunningen vergeleken. Isoleren Repliceren Aantal </td> Verwatering Tubes Microtiterplaat (Plastic) Poly-propyleen, Greiner Polystyreen Glas Plastic Plastic 1 uur Plastic 1uur / Intermediate 1uur Greiner Corning Nunc S. aureus ATCC 29213 1 0.06 0.03 0.03 0.03 0.06 0.03 0.06 0.03 2 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.06 3 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 E. faecalis ATCC 29.212 <td> 1 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 2 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 3 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 S. pneumoniae ATCC 49619 1 0,015 0,015 0,015 0,015 0,008 0,008 0,008 0,008 2 0,015 0,015 0,015 0,015 0,008 0,015 0,008 0,008 Glas = Beginvoorraad in glazen fles, die onmiddellijk tussenliggende concentratie te makens in plastic buizen, onmiddellijk wordt gebruikt voor bouillon verdunningen te maken. Plastic = Beginvoorraad in plastic centrifugebuis, onmiddellijk wordt gebruikt om intermediaire concentraties te maken in plastic buizen, onmiddellijk wordt gebruikt voor bouillon verdunningen te maken. Plastic 1 uur = Beginvoorraad in plastic centrifugebuis, laat zitten op de bank gedurende 1 uur vervolgens gebruikt om intermediaire concentraties te maken in plastic buizen, onmiddellijk wordt gebruikt om de concentratie te maken in bouillon. Plastic 1 hr / Intermediate 1 uur = Beginvoorraad in plastic centrifugebuis, laat zitten op de bank gedurende 1 uur vervolgens gebruikt om intermediaire concentraties te maken in plastic buizen, laat zitten op de bank gedurende 1 uur vervolgens gebruikt om de concentratie te maken in bouillon. Tabel 7. dalbavancin MIC resultaten met behulp van Stock verdunningen Voorbereiding in plastic en glazen buizen en MIC Plate Plastic Types. Resultaten ofa dalbavancin MIC studie die effect van het gebruik van plastic of glazen buizen bij het opstellen van de voorraad oplossingen en ook effect van het gebruik van verschillende bronnen en soorten kunststof voor microtiterplaten vergeleken.

Discussion

De volgende methode gegevens worden gepresenteerd voor aanvullende overwegingen bij de voorbereiding van dalbavancin MIC testen. Het ontwerp van de MIC panel zal afhangen van het aantal antimicrobiële middelen te testen (bijv., Dalbavancin alleen of meerdere middelen) en soorten bacteriën te testen. De dalbavancin concentraties dient de interpretatieve breekpunten omvatten alle soorten bacteriën te testen en het gehele reeks verdunningen verwacht ten minste één QC stam. De antimicrobiële verdunningsreeks kan hetzij in rijen of kolommen worden georganiseerd afhankelijk van het aantal antimicrobiële middelen en / of isolaten / plaat en de wijze van inoculatie. Het volume van de dalbavancin poeder en bouillon moet worden berekend om te verzekeren dat optimale hoeveelheden worden geproduceerd en afval is minimaal. Voor het voorbeeld gebruikt in deze publicatie, zijn de volumes op basis van de voorbereiding van twee MIC panelen. Catie aangepast Mueller Hinton bouillon moet worden voorbereid en de autoclaaf volgens de mensfabrikaat instructies en steriliteit van de media geverifieerd. MIC panelen kunnen worden vervaardigd en gebruikt op dezelfde dag van preparaat of zij kunnen worden getest met geschikte voor kwaliteitscontrole en gevalideerde panelen bevroren bewaard voor toekomstig gebruik. Het is belangrijk steriele technieken gedurende de procedure.

Er is geen strikte criteria voor de verificatie van inoculum concentratie kolonietellingen. Kolonietellingen kan aanvankelijk worden gecontroleerd voor elke geteste en / of periodiek naar de verdunningsstap die in stap 4,2 valideren species. Het is belangrijk dat de geldigheid van de 0,5 McFarland standaard ook regelmatig wordt gecontroleerd met E. coli ATCC 25922 onder toepassing van een procedure vergelijkbaar met stap 4,5. Als de resultaten niet overeen met 1-2 x 10 8 CFU / ml, een nieuwe 0,5 McFarland standaard moet worden verkregen. Als de kolonietellingen MIC putten buiten het toegestane bereik (2-8 x 10 5 CFU / ml en MIC resultaten van de klinische isolaat (s) variëren van the verwachte normale verdeling (bv. 0,03-0,12 ug / ml voor S. aureus) en / of MIC resultaten voor kwaliteitscontrole isolaat (s) zijn buiten verwachting bereiken, validatie testen is noodzakelijk en wijze modificatie kan worden gerechtvaardigd. Er wordt voorgesteld een gevalideerde 0,5 McFarland standaard wordt gebruikt om het aantal kolonies (s) herhaald en als de resultaten weer buiten de verwachte resultaten dient het inoculum verdunning zoals uitgevoerd in stap 4.2 worden aangepast en de MIC herhaald. Merk op dat een zuiverheid controle nodig is, zelfs als een kolonie telling wordt uitgevoerd omdat het kiemgetal procedure maakt gebruik van een verdunde volume die kunnen lagere concentraties van verontreinigende organismen niet per se op te sporen.

Voor een MIC-test is geldig worden beschouwd, moet acceptabel groei plaatsvinden in de groei controle ook. Voor de meeste bacteriën die worden getoetst dalbavancin (bijv., Stafylokokken, streptokokken en enterokokken, de groei zal worden gezien als een knop (typisch> 2 mm) en minder frequently, kan de groei weergegeven als troebelheid in de put. In tegenstelling tot sommige antimicrobiële middelen die kunnen vertonen achterstand effect als de concentratie te verhogen, worden dalbavancin eindpunten meestal goed gedefinieerd. Er zijn verschillende weergave inrichting ter lezing microverdunnings- tests te vergemakkelijken, die kunnen worden gebruikt om dalbavancin bevattende platen gelezen zolang er geen compromis in het vermogen om de groei te onderscheiden in de putjes.

De kritische stappen in het protocol zijn aan de delen van de procedure die verband houden met de oplosbaarheid van dalbavancin en toevoeging van P80. Het is belangrijk dat de maximale concentratie van dalbavancin gebruikte niet groter dan 1600 ug / ml, dat DMSO wordt gebruikt als oplosmiddel en die tussenliggende concentraties worden bereid in DMSO alvorens de brij verdunningen zodat de eindconcentratie van DMSO in de MIC panel putten niet groter dan 1%. DMSO is hygroscopisch en dus het gebruik van oudere flessen DMSO was consideration wat dalbavancin oplosbaarheid. Echter, terwijl een kleine BMD studie met kwaliteitscontrole stammen dit blijkt niet een belangrijke variabele te zijn (zie de resultaten sectie), het is een goede gewoonte om nieuwe of onlangs geopende flessen DMSO gebruiken. Het is ook belangrijk dat P80 wordt toegevoegd aan de bouillon in de laatste stap van geneesmiddelverdunning preparaat en is bij een uiteindelijke concentratie van 0,002% in het MIC ook.

De BMD procedure hier opgenomen gebruik voorbereiding van de MIC-panelen met behulp van 50 ul / put / goed dus op dalbavancin en P-80-concentraties twee keer de finale concentratie en toevoeging van entstof met 50 ul die laatste volume / put is 100 pl. Deze werkwijze maakt een MIC paneelformaat worden geproduceerd voor het testen van zowel S. aureus en S. pneumoniae omdat gelyseerd paarden bloed kan worden toegevoegd aan het inoculum. Alternatieve methoden voor het bereiden van MIC platen met 100 gl / putje met toevoeging van maximaal 10 gl / putje worden in deCLSI en ISO procedures.

De dalbavancin gevoelig breekpunt voor S. aureus is ≤0.12 ug / ml (FDA bijsluiter). Zoals blijkt uit de recente bewaking, de meeste isolaten worden geremd door dalbavancin in gehalten van 0,06 ug / ml 15. Met een vatbare breekpunt nabij de modale MIC kan elke variatie in MIC gevolge van werkwijze verschillen beïnvloeden de vatbaarheid tarieven. Omdat de BMD procedure voor dalbavancin bevat een aantal unieke stappen (in het bijzonder het gebruik van DMSO in de voorbereiding van de voorraad en intermediaire geneesmiddel verdunningen en 0,002% P80 in het MIC goed, is het noodzakelijk dat de methode precies wordt gevolgd. De S. aureus QC organisme (ATCC 29.213) met een zeer duidelijke dalbavancin modale MIC van 0,06 ug / ml, is een goede indicator van de methode variatie en moet regelmatig worden gebruikt om de BMD-methode te valideren. Als MIC resultaten zijn met de verwachte range van 0,03-0,12 ug / ml, maar zijn trending om ofwel de lage of high kant van dit bereik, wordt verdere validatie van de methode gerechtvaardigd.

Toevoeging van 0,002% P80 wordt aanbevolen voor alle relevante Gram-positieve organismen (staphylococcci, enterokokken en streptokokken.) Het is echter opmerkelijk dat het is aangetoond dat paardenbloed gelyseerd werkt vergelijkbaar met P-80 ten opzichte van de anti-bindende vermogen en dat de toevoeging van P-80 te CAMHB + LHB geen additioneel effect op dalbavancin streptokokken MIC resultaten.

Er is geen disk diffusie werkwijze voor het testen dalbavancin en vanwege de slechte correlatie van BMD en advertentieresultaten, gevoeligheidstests van dalbavancin met de AD methode wordt afgeraden 12, 14. BMD methode worden gebruikt om de toekomstige evaluatie van dalbavancin gevoeligheid en als een gouden standaard voor de commerciële ontwikkeling van antimicrobiële gevoeligheidstests.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

Materials

Dalbavancin Metrics, Inc. Greenville, NC BI-397
Vancomycin Sigma-Aldrich St. Louis, MO C5793
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth Becton Dickinson Sparks, MD 212322
Lysed horse blood Cleveland Scientific Bath, OH
Dose-it peristaltic pump Integra Biosciences Hudson, NH
Multi-channel pipet (Viaflo II) Integra Hudson, NH 4164
12 channel pipet (Matrix) ThermoFisher Scientific Waltham, MA
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) VistaLab Brewster, NY
96 well microplate Greiner Bio-one Monroe, NC 650161
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
16x125mm disposable glass tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
12x17mm snap cap, polystyrene tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
16 mL centrifuge tubes BioExpress Kaysville, UT C-3394-2
Reagent reservoirs Integra Biosciences Hudson, NH 4312
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) Biologix Lenexa, KA 65-0001,65-0010
Tryptic soy agar + 5% sheep blood Becton Dickinson Sparks, MD
Incubator (ambient) Sanyo
Incubator (5% CO2) Sanyo
Analytical balance  ThermoFisher Scientific Waltham, MA
Gloves Kimberly-Clark 52817
Lab coats
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boucher, H. W., et al. Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection. The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).
  2. . . M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).
  3. . . M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).
  4. . Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO/FDIS. 20776-1, (2006).
  5. Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin. Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).
  6. Turnidge, J., Paterson, D. L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).
  7. Rennie, R. P., et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent. Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).
  8. Arhin, F. F., et al. Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing. Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).
  9. Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies. Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).
  10. Ribbon Panel, B. l. u. e. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).
  11. Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity. Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).
  12. Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132. ASM. , (2012).
  13. Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms. Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).
  14. Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).
  15. Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012). Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).

Tags

Antimicrobial Susceptibility TestingDalbavancinBroth MicrodilutionCLSIISODMSOPolysorbate 80Staphylococcus AureusMRSAStreptococcusEnterococci

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. J. Vis. Exp. (103), e53028, doi:10.3791/53028 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image