JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Ex vivo beeldvorming van postnatale cerebellaire Korrel Cell Migration met behulp van confocale Macroscopie

Published: May 12, 2015
doi:
10.3791/52810
, , , ,
1PRIMACEN, Cell Imaging Platform of Normandy,Inserm, IRIB, University of Rouen, 2Department of Neurobiology, School of Medicine,Yale University

Summary

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Abstract

Tijdens de postnatale ontwikkeling, onvolwassen granulecellen (prikkelende interneuronen) vertonen tangentiële migratie in de externe granulaire laag, en vervolgens radiale migratie in de moleculaire laag en de Purkinje cellaag aan de interne granulaire laag van de cerebellaire cortex bereiken. Default in trekkende processen induceert ofwel celdood of onjuiste plaatsing van de neuronen, wat leidt tot tekorten in diverse cerebellaire functies. Centripetal granule celmigratie omvat verschillende mechanismen, zoals chemotaxis en extracellulaire matrix degradatie, om de cellen te leiden naar hun uiteindelijke positie, maar de factoren die celmigratie in elke corticale lagen regelen slechts gedeeltelijk bekend. Bij onze werkwijze, zijn acute cerebellaire plakjes bereid uit P10 ratten worden granule cellen gemerkt met een fluorescent cytoplasmatisch merker en weefsels gekweekt op membraan inserts 4-10 uur voordat real-time monitoring van celmigratie door confocale macroscopie bij 37 ° C in deaanwezigheid van CO 2. Tijdens hun migratie in de verschillende corticale lagen van het cerebellum, kan granule cellen worden blootgesteld aan neuropeptide agonisten of antagonisten, proteaseremmers, remmers van intracellulaire effectoren of zelfs toxische stoffen zoals alcohol of methylkwik hun mogelijke rol in de regulering van de neuronale migratie te onderzoeken .

Introduction

In ontwikkelingslanden cerebellum, zijn acht verschillende soorten neuronen geproduceerd opeenvolgend tussen de tweede week embryonale en postnatale tweede week bij knaagdieren 1. Afkomstig aanvankelijk uit, een primaire germinal zone, onrijpe korrel cellen (GC) zijn de laatste neuronen worden geproduceerd uit de externe granulaire laag (EGL), een tweede germinal zone 2. Gedurende de eerste drie weken postnataal, de cerebellaire cortex een gelaagde structuur in vier lagen waaronder EGL, de moleculaire laag (ML), de Purkinje cellaag (PCL) en de interne granulaire laag (IGL) (figuur 1). Door middelpuntzoekende migratie, onvolwassen GC, glutamaat interneuronen, bereikt de IGL binnen ongeveer 2 dagen. Door de derde postnatale week, de EGL verdwijnt en de IGL vormt wat de granulaire laag (GL) in de volwassen cerebellum genaamd. In de GL, GC ontvangt prikkelende synaptische input van bemoste vezels en unipolaire borstel cellen enremmende synaptische input van Golgi cel axonen. In de ML, GC axonen maken prikkelende synapsen met GABAergic neuronen waaronder Purkinjecellen, mand cellen, stellaatcellen, en Golgi cellen 2.

Real-time observatie van de cel beweging in acute cerebellaire plakjes verkregen uit vroege postnatale knaagdieren toont aan dat GC passen hun vorm gelijktijdig met veranderingen in de modaliteit en de snelheid van de migratie tijdens hun route in de cerebellaire cortex 3. Gedurende de eerste twee weken postnataal, GC precursors actief prolifereren bovenaan de EGL. In het middendeel van de EGL, postmitotische GC migreren tangentiaal in de richting van hun grotere proces. Aan de EGL-ML grens, GC vertragen hun beweging, de cellen beginnen om een ​​korte verticale neergaande proces voeren in de ML. In de ML, GC hebben een verticaal langwerpig cel lichaam, een dunne slepende proces en een meer volumineuze toonaangevende proces, en migreren radiaal langs de Bergmann gliacellen vezels. In dePCL, GC stoppen hun beweging, maar na een langdurige stationaire fase (2 uur), zij het PCL-IGL grens over te steken. In het IGL, GC migreren naar de bodem van de laag in afwezigheid van gliale vezeldrager. Zodra de uiteinden van de leidende proces aanpak van de IGL-witte stof (WM) grens, GC langzaam en stoppen hun beweging. Dwarsdoorsneden van het cerebellum zijn de voorkeur voor tangentiële migratie studies in de EGL terwijl sagittale schijfjes zijn gewijd aan migratie radiaal in de ML, PCL en IGL. Sommige regulerende factoren van GC bewegingen waaronder neuropeptiden (bijv, somatostatine, PACAP) zijn tot nu toe geïdentificeerd, maar de complete mechanismen betrokken bij het ​​spatiotemporele controle van GC migratie in elke corticale lagen zijn nog grotendeels onbekend 1,4,5,6.

GC migratie is onderzocht in de afgelopen 20 jaar door middel van video- en confocale microscopie met behulp van doorvallend licht verlichting voor geïsoleerde gekweekte cellen of fluorescentie detectie voor ACUte cerebellaire plakjes. Aanvankelijk lipofiele Dil en meer recent "Cell Tracker" kleurstoffen en cel tot expressie fluorescerende eiwitten werden gebruikt voor confocale of twee-foton microscopie 7,8. Succesvolle experimenten afhankelijk van een aantal specifieke procedures die het protocol eenvoudig maar niet gemakkelijk. In het bijzonder acute plakjes tijdens observaties worden gestabiliseerd het algemeen met een zelfgemaakte nylon mesh-netwerk 9. De intensiteit van licht verlichting moet zo laag mogelijk fototoxiciteit en fotobleken vermijden door multipunt scanning confocale microscoop benadering voorgesteld zijn. Bovendien, de temperatuur en CO 2 zijn de belangrijkste milieu-parameters, omdat instabiliteit kan neuronale migratie beïnvloeden. Te vergemakkelijken en te verfijnen van de experimentele procedures, hebben we een confocale macroscopie protocol dat slice bewegingen beperkt, zorgt voor een constante milieu-parameters, vermindert photobleaching, verhoogt gezichtsveld (in de orde van millimeter) en consequ ontwikkeldently het aantal cellen (tientallen), die kunnen worden gevolgd door middel van beeldanalyse. Aldus, 180 urn dikke plakken worden gekweekt op membraan inserts en 6-well platen direct overgebracht onder een 2X gemotoriseerde doelstelling van commerciële confocale macroscoop voorzien van een grote incubatiekamer, temperatuur en CO 2 controllers en trillingsregelstelsel. Time-vervalt en z-stacks worden dan uitgevoerd over verscheidene uren, farmacologische gereedschappen of biologisch actieve moleculen kunnen worden toegevoegd of afgegeven in het incubatiemedium. Deze werkwijze kan ook worden aangepast om de migratie van andere soorten neuronen in het cerebellum en cerebrum in verschillende ontwikkelingsstadia te bestuderen.

Protocol

Dieren (mannelijk of vrouwelijk Wistarratten) zijn geboren en getogen in een geaccrediteerde dier faciliteit (goedkeuring B.76-451-04), volgens de Franse gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De experimenten werden uitgevoerd onder toezicht van erkende onderzoekers (MB, DV en LG), in overeenstemming met de Europese richtlijn Gemeenschapsraad (2010/63 / EU van 22 september 2010) en het Franse ministerie van Landbouw. 1. Voorbereiding van de Media en Gereedschappen In een biologische veiligheidskast, bereiden 1x Hank's BSS (HBSS) in steriel water 10x voorraadoplossing van CaCl 2 (1,85 g / l) / MgSO 4 (0,9767 g / l) zonder MgCl2. Voeg NaHCO3 (350 gg / ml), waarbij oplossing van HBSS 1x. In een biologische veiligheidskast, voeg N2 supplement (uit een voorraadoplossing 100x) en penicilline (100 eenheden / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) oplossing van Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) voedingsmengselture F-12 (1: 1). In steriele condities Bereid een aliquot (25 pl, 2 mM) van het cytoplasmatische fluorescente kleurstof genoemd Cell Tracker Green in DMSO (1,075 ml van 1 mg). Verdun een aliquot van 5 ml van DMEM in een 15 ml conische buis. Bereid gevulde ice-emmer media bij 4 ° C te houden. Ontsmet laboratorium bankje tops en gereedschappen met 70% ethanol. 2. Dissectie van de kleine hersenen van P10 Rats Snel onthoofden rat pups (P10) met gebogen operationele scharen achter de oren, om het begin van het ruggenmerg te krijgen. Aan de achterzijde van het onthoofde hoofd, maken middellijn incisie van de huid van de hals aan de neus met fijne iris schaar en scheiden de huid van de schedel met fijne iris schaar en Dumont # 3 tang. Gebruik fijne iris schaar om delicaat maken twee laterale incisies van de basis naar de rostrale regio van de schedel. Verwijder de ontleed schedel met twee # 3 tang. Maak de behavanaf elke hechting met de schedel volgens dezelfde tang. Breng de hersenen met de lepel uiteinde van een spatel om petrischaal (Ø 35 mm) met 2 ml ijskoude HBSS medium. Plaats de petrischaal met de hersenen in groter petrischaal (Ø 100 mm) vol met ijs en transfer naar het stadium van de stereomicroscoop. Onder een stereomicroscoop, isoleer het cerebellum van de hersenen met behulp van twee dilaceration # 3 tang. Ook verwijdert u de resterende ruggenmerg en de pial-membraan. Breng het cerebellum in een nieuw HBSS-gevulde petrischaal (Ø 35 mm, 2 ml) met de lepel einde van een spatel en blijf op ijs. 3. Voorbereiding van de Acute Cerebellaire Slices Onder de stereomicroscoop, snijd het cerebellum tussen de vermis en de rechter hersenhelft zoals aangeduid door de twee koppen pijl in figuur 2A een standaard scalpel handvat # 3 vaste stof en een # 15 chirurgisch mes. Doe een druppel cyaanoacrylate lijm op de vibratome objectplaatje en wacht 15-25 sec aan giftige dampen van oplosmiddelen te elimineren. Verzamel de cut cerebellum met de lepel einde van een spatel en verwijder overtollige HBSS met schone papieren handdoeken. Breng het cerebellum dicht bij het monster disc. Bevestig de snijrand met het model schijf en wacht 10 sec. Plaats het monster schijf in de bufferbak de manipulator en draaien zodat de dwarsas van het cerebellum loodrecht op de meshouder. Bevestig het monster schijf met een inbussleutel en vul voorzichtig de buffer lade met HBSS medium totdat het cerebellum is bedekt. Load gemalen ijs in het koelbad. Reinig het blad driemaal met 70% ethanol om een ​​olie te elimineren. Steek het mes in de meshouder en veilig met klemschroef. Plaats het mes rand vlak achter de achterste rand (uit het zicht gebruiker) van het monster en het definiëren als uitgangspunt. Gebruik vooruit commando om t te definiërenHij eindpunt na de voorrand van het monster. Selecteer snijsnelheid op 2,5 en snijden frequentie 8. Selecteer trimmen dikte bij 180 urn. Start weefsel snijden. Pick-up elke sectie met een breed-boring glas afgekapt Pasteur pipet en transfer naar HBSS bevattende petrischaal (Ø 35 mm) op ijs bewaard. Met behulp van twee # 5 tang, verwijder de hersenvliezen voorzichtig uit de kleine hersenen wanneer bemoeien met het mes. Verzamel maximaal 5 segmenten per cerebellum (Figuur 2B, C). Verwijder de hersenvliezen uit de cerebellaire schijfjes voorzichtig met twee # 5 tang onder de stereomicroscoop en scheid de melkklieren zachtjes betere probe laden. 4. Fluorescerende kleuring van Living Interneurons Transfer cerebellaire plakjes met een breed-boring glas afgekapt Pasteur pipet om een ​​6-well plaat (max 3 sneetjes / per well). Zuig de HBSS medium. Incubeer plakjes (3 max) in 5 ml loading oplossing van de fluorescente kleurstof (10 uM). Tegen licht te beschermen, hebben betrekking op de microplaat met aluminiumfolie. Zet het op een gyro-bewegende tafel bij 35 rpm gedurende 10 min bij kamertemperatuur naar cel labeling vergemakkelijken. Transfer plakjes op het membraan van een Transwell voegen (3,0 micrometer poriegrootte Figuur 2D) met een brede boring glas afgekapt Pasteur pipet. Zuig het laden van medium met een pipet. Verwijder de insert en vul het goed met 1,9 ml DMEM. Vervang het inzetstuk en voeg 100 ul DMEM bovenop het segment aan het weefsel bedekken. Plaats de plaat met de inserts cultuur in de kamer incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 2 uur die voldoende is om GC observeren in de ML. Lie weefsels vlak tot beslag op de insert membraan (Figuur 2E) mogelijk te maken. Zorg ervoor dat de schijfjes niet drogen. 5. Ex vivo Imaging Door confocale Macroscopie Breng de plaat zonderhet plastic deksel in een incubator op de stand van een confocale macroscoop bevestigd. Plaats een glazen deksel op de plaat insert van de macroscoop. Houd de temperatuur van de kamer bij 37,0 ° C ± 0,5 ° C, en leveren de schijfjes met een constante gasstroom (95% O2, 5% CO 2) door het inzetstuk om de pH constant te houden. Wacht 2 extra uur voor time-lapse experiment. GC migratie zichtbaar in de weefselcoupes, verlichten de bereiding van een 488 nm golflengte met behulp van een laserdiode door een confocale laser scanning macroscoop uitgerust met een X2 droge objectief (werkafstand: 39 mm, diameter: 58 mm, NA = 0,234), en detecteert fluorescentie-emissie 500-530 nm. Om fijn oplossen van de beweging van GC, beelden verwerven met een extra optische zoomfactor van 1,5 tot 2,0. Verzamel afbeeldingen GNS in een focal plane of tot 10 verschillende beeldvlakken langs de z-as om de 30 minuten gedurende maximaal 12 uur. </li> Indien nodig, verwijder het glazen deksel en kleine volumes (1-10 ul) van biologische activators of remmers in DMEM toe te voegen met een 10 ul pipet om hun effect op GC migratie te bestuderen. 6. Cell Tracking Voor elk moment van de film, uit te voeren z-stack projectie door de Ecart-type mode in ImageJ. Moduleren het contrast en de helderheid van de opeenvolgende foto's om de identificatie en het volgen van gelabelde GC vergemakkelijken. Kaart veilig eigen positie op de referentie-snapshot (bij t = 0). Gebruik de "Manual volgen" plugin in de Analyse Particle Menu en bepalen door te klikken op het zwaartepunt van elke cel lichaam tijdens de time-lapse. De ruwe data bijhouden in een spreadsheet exporteren. Reorganiseren van de uitgevoerde ruwe volgen gegevens van ImageJ met een smart home-made programma (http://primacen.fr, geschreven in PHP-code), die elke cel en de bijbehorende posities te identificeren. Met behulp van het programma, calculate de totale afgelegde afstand en de gemiddelde snelheid van migratie voor elke cel. Classificeren en te vergelijken kenmerken van celmigratie in de controle en de behandeling onder de juiste filters met behulp van hetzelfde programma.

Representative Results

In de vroege postnatale cerebellum, GC vertonen significante veranderingen in de wijze en snelheid van migratie het overschrijden verschillende corticale lagen 1 (figuur 1). Dit gedeelte illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen door het bestuderen van GC migratie in hun natuurlijke cellulaire milieu. P10 rat cerebellaire weefselcoupes met de groene fluorescente kleurstof worden onderzocht onder een confocale macroscoop (figuur 3A) en laten we zien dat de GCs migreren radiaal in de ML met een gemiddelde snelheid van 18 gm / hr (Figuur 3B, C). Tot nu toe is de rol van interacties / communicatie tussen neuronale en gliacellen inclusief regulerende factoren en moleculaire mechanismen betrokken bij de controle van celmigratie in elke corticale lagen grotendeels onbekend. Bijgevolg is het belangrijkste probleem is om neuropeptiden, neurotransmitters, neurotrofinen en extracellulaire matrix componenten die een rol kunnen spelen in deze corticale layer-speci identificerenfic veranderingen van de snelheid tijdens hun migratie. Hypofyse adenylaat cyclase-activerende polypeptide (PACAP) wordt voornamelijk aangetroffen in de PCL, maar ook in de ML en IGL tijdens de eerste twee weken postnataal bij knaagdieren 7,10,11. Toepassing van PACAP38 (10 -6 M) aan het kweekmedium leidde tot een 79% snelheidsafname van de GC in de ML. Bijvoorbeeld, de migratie snelheid van GC's in de ML daalde van 11,9 um / uur in controleomstandigheden 2,5 um / uur na toediening van PACAP38 (figuur 4A). Tissue-type plasminogen activator (tPA) is een lid van de proteolytische cascade die leidt tot de afbraak van de extracellulaire matrix (EM) componenten zoals celadhesie moleculen of laminine 12,13. tPA en plasminogeen, een substraat van tPA worden aangetoond in corticale lagen tijdens de ontwikkeling van de postnatale cerebellum 14,15,16. Toediening van PAI-1 (10 -7 M), een remmer van endogeen tPA, verminderd met 78% GCmigratie in de ML. Bijvoorbeeld, GC verminderde migratie snelheid in de ML van 19,2 um / uur in controleomstandigheden 4,2 um / uur na toevoeging van PAI-1 (Figuur 4B). Deze resultaten geven aan dat PACAP oefent een direct remmend effect van GC bewegingen en dat de serineprotease tPA vergemakkelijkt de migratie van GC in de ML van het ontwikkelen cerebellum rat. Figuur 1: 3D-weergave van GC migratie in de postnatale cerebellaire cortex. 1-4, Uitbreiding van GC processen en tangentiële migratie in de EGL. 5, Radial migratie in de ML langs Bergmann gliacellen vezels. 6, Transient stationaire fase in de PCL. 7, Glial-onafhankelijke radiale migratie in de IGL. 8, Voltooiing van GC migratie in de IGL GC, korrel cel, in het rood;. EGL, Externe granulaire laag; B, Bergmann glia, in donkerpaars, G, Golgi cel, in het geel, cf, klimmen vezels, in het blauw, g, postmigratory korrel cellen, in lichtgroen, IGL, interne granulaire laag; mft, bemoste vezels terminal, in donkergroen, ML, moleculaire laag; P, Purkinje cel, in lichtpaars, PCL, Purkinje cellaag. Dit cijfer is aangepast van 5. Figuur 2: Ex vivo cultuur van P10 cerebellaire plakjes (A) Dissected cerebellum van P10 rat.. Schaal bar = 6 mm. (B) Microfoto van het leven 180 micrometer dikke cerebellaire slice door stereomicroscopie. Schaal bar = 3 mm. (C) AtEen hogere vergroting, de vier corticale lagen (EGL, ML, PCL, IGL) van het cerebellum al onderscheiden. Schaal bar = 1 mm. (D) na fluorescentielabelling worden weefselcoupes voor cultuur inserts (24 mm diameter) werd in een 6-wells plaat. (E) Schematische weergave van een cultuur insert met weefselkweek behandeld polyester membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Dynamische migratie van GC's in de corticale lagen van rat P10 cerebellum (A) Macroconfocal weergave (xyz, 2D projectie) van een P10 rat cerebellaire slice waarin GCs gelabeld met een groen fluorescerende kleurstof cytoplasmatische.. Scale bar = 75 micrometer. (B) Time-lapse imaging toont GCbewegingen in de ML door confocale macroscopie gedurende 4 uur in controle omstandigheden. Asterisk (*) symbool markeert de GC soma. Verstreken tijd (in min) wordt aangegeven op de onderkant van elke microfoto. Scale bar = 10 micrometer. (C) Sequential veranderingen in de afgelegde afstand van GC soma. Figuur 4:. Effect van neuropeptide en protease inhibitor van GC migratie (A) GC werd in de ML gevolgd door confocale macroscopie gedurende 2 uur bij controleconditie en vervolgens gedurende 2 uur bij aanwezigheid van hypofyse adenylaat cyclase-activerende polypeptide (PACAP). (B) GC werd in de ML gevolgd door confocale macroscopie gedurende 2 uur bij controleconditie en vervolgens gedurende 2 uur bij aanwezigheid van plasminogeen activator inhibitor-1 (PAI-1).

Discussion

Dit protocol beschrijft de cultuur van acute P10 rat cerebellaire schijfjes in het Transwell systeem en de fluorescerende etikettering van GC met een groen fluorescerende kleurstof om celmigratie te bestuderen tijdens de postnatale ontwikkeling door middel van confocale macroscopie. Dit protocol maakt observaties van celmigratie gedurende een periode tot 12 uur en het testen van de mogelijke rol van regulerende factoren in migratie, agonisten of antagonisten van neuropeptiden, enzymremmers, signaaltransductie modulatoren of toxische stoffen tijdens het experiment. Een kleine opening in het membraan insert met een pipetpunt moet toediening van verbindingen in het incubatiemedium te vergemakkelijken. Een zelfgemaakte gekromde tip pipet kan worden gebruikt om de afgifte van de oplossing te vergemakkelijken.

Een onderwerp van celmigratie studies op levend weefsel slices is dat de bewegingen van het weefsel zelf kan cell tracking moeilijk. Overwegende dat de vorige benaderingen voorgesteld om voorzichtig te stabiliseren slices met een nylon gaas of een dunne laag van rattenstaart collageen 7,17, een groot voordeel van deze techniek is de eenvoudige en directe overdracht van een 6-well kweekplaat met cerebellaire plakjes op het membraan inserts van de CO 2 incubator onder doelstelling van een confocale macroscoop. Geïntegreerde temperatuur en CO 2 controllers bieden ook passende en voortdurende milieu-parameters essentieel zijn voor celmigratie 9. Daarom worden kweekcondities gehouden tijdens observaties en weefsels bewegingen worden geminimaliseerd aangezien segmenten goed bevestigd aan het membraan insert. Stabilisatie van het weefsel wordt gecontroleerd door het volgen van de positie van slice randen of Purkinje cellen die moeten worden vastgesteld verwijzingen tijdens de acquisitie. Bovendien kan cerebellaire segmenten (tussen 12 en 18) verdeeld in 6 wells van de plaat snel waargenomen in detail met een gemotoriseerde fase en een optische zoom. Door de grote werkafstand (X2, 39 mm) van de droge doelstelling, epi-observation vrij is van immersie en het beheer van verbindingen in het kweekmedium is veel gemakkelijker. Daarom macroscopie milieu parameters en cultuur support overeenkomsten in CO 2 incubator en confocale leiden tot maximale behoud van het biologische monster.

Een ander voordeel van het protocol is het groot gezichtsveld en daardoor het grote aantal cellen die gelijktijdig kunnen worden waargenomen. Zo hebben we eerder vastgesteld dat de dichtheid van fluorescerende GC met radiale migratie in de ML was 1124 ± 138 cellen / mm 2 18. Confocale macroscopie (X2, NA = 0,234) een onderste laterale resolutie in vergelijking met confocale microscopie (40X, NA = 1,25), maar cellichamen van GC's kunnen gemakkelijk worden gevolgd en de gemiddelde snelheid van migratie vergelijkbaar tussen de twee technologische benaderingen 7,18 .

Naast de technische verbetering voor het aankopen, de kwaliteit van het weefsel plakjes en the kwaliteit van de etikettering zijn belangrijke punten voor een succesvolle experimenten. Altijd media en weefsels op het ijs tijdens de dissectie processen, te elimineren olie op vibratome bladen en niet plakjes weefsel te gebruiken in contact met lijm. Sagittale en transversale secties zijn ingericht om respectievelijk radiale en tangentiële migratie. Gebruik verschillende lengtes incubatie passende detectie in de verschillende corticale lagen van het cerebellum. Lange incubatietijden (tot 8 uur) nodig om de migratie van talrijke GC detecteren in de PCL en IGL. Omdat GC migratie is een fysiologisch proces tijdens specifieke tijdruimtelijke ramen, de positieve controle is dat de cellen hebben om goed te migreren. Vooral talrijke spindel GC in het ML is een van de belangrijkste gezondheidsproblemen indicator sagittale cerebellaire plakjes. Voor het starten van experimenten, is observatie van GC bewegingen in de ML voorgesteld. Inderdaad moet de vorm van GC met verticale richting cellichaam worden beschouwd als een referentiepunt ac beginneninquisitie opeenvolgende control (2 uur) en behandeling (2 uur) perioden die gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd in de ML.

Fluorescerende kleurstoffen zoals Cell Tracker familie of fluorescerende eiwitten tot expressie gebracht door genetische constructen kunnen worden gebruikt als tracers celmigratie studies. Vanwege de langzame kinetiek van GC migratie (1 stack elke 30 min), kan veelkleurig experimenten worden uitgevoerd in sequentiële modus sinds 4 lasers balken (405, 488, 532 en 633 nm) wordt op het systeem. Gezien middelpuntzoekende en centrifugaal radiale migratie, het bijhouden van andere interneuronen kunnen ook worden gerealiseerd 18. In het bijzonder kunnen minder talrijke celtypen gemakkelijker worden gelokaliseerd met een groot beeldveld. Tenslotte kan dit protocol worden gebruikt om celmigratie studeren in andere stadia van ontwikkeling van het cerebellum, maar ook andere hersengebieden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het Instituut voor Onderzoek en Innovatie in de biogeneeskunde (IRIB), de Cell Imaging Platform van Normandië (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, de Universiteit van Rouen, het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO – Perene, Interreg 4A), de LARC-Neurowetenschappen Network en de regio Haute-Normandie.

Materials

Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 Sigma-Aldrich D8437
Hank's balanced salt solution 10X Sigma-Aldrich H1641
PACAP38 INRS, Canada Bourgault et al., 200919
PAI-1 Calbiochem 528208
N-2 supplement Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen O973
cyanoacrylate glue Loctite
Cell Tracker Green CMFDA Invitrogen C2925
Polyester Transwell-Clear inserts Corning 3452
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781
6-well cell culture cluster Corning 3516
DMSO Fisher Scientific BP231-100
Tissue culture dish 35 mm diameter BD Falcon 353004
Tissue culture dish 100 mm diameter Thermo SCIENTIFIC 130182
Polypropylen tube (15 ml) BD Falcon 352096
Ethanol 70% Fisher Chemical E/0800DF/21
biological safety cabinet fume hood Thermo Scientific MSC9 Class II A2
adjustable-volume pipette (0,5-10 µL) Eppendorf 4910 000.018
gyro-rocker, SSL3 Stuart
CO2 incubator, Hera Cell 150 Thermo Scientific
vibrating blade microtome, VT1000S Leica Microsystems
confocal macroscope, TCS LSI Leica Microsystems
temperature controller PeCon
CO2-controller PeCon
Stereomicroscope, M205 C Leica Microsystems
Operating scissors, curved, blunt/blunt Medicon 03.03.17
Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp FST 149090-11
Dumont #3 and #5 forceps FST 11293-00 and 11252-20
Vibratome injector blades/single edge Leica Microsystems 39053250
standard scalpel handle #3 solid FST 10003-12
surgical blade #15 Swann-Morton 205
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. Migration in the Cerebellum. Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).
  2. Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
  3. Komuro, H., Rakic, P. Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex. Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).
  4. Komuro, H., Yacubova, E. Recent advances in cerebellar granule cell migration. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).
  5. Fahrion, J. K., et al. Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).
  6. Raoult, E., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).
  7. Cameron, D. B., et al. Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).
  8. Renaud, J., et al. Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells. Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).
  9. Komuro, H., Rakic, P. Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations. Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).
  10. Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex. Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).
  11. Hannibal, J. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).
  12. Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones. Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).
  13. Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration. Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).
  14. Friedman, G. C., Seeds, N. W. Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum. Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).
  15. Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding. Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).
  16. Basham, M. E., Seeds, N. W. Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain. Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).
  17. Bourgault, S., et al. Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor. Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).

Tags

Cerebellar Granule CellPostnatal DevelopmentTangential MigrationRadial MigrationCerebellar CortexCell MigrationConfocal MacroscopyReal-time MonitoringNeuropeptideProtease InhibitorIntracellular EffectorAlcoholMethylmercury

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bénard, M., Lebon, A., Komuro, H., Vaudry, D., Galas, L. Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy. J. Vis. Exp. (99), e52810, doi:10.3791/52810 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image