Экс естественных изображений послеродовой мозжечка ЗК миграции с помощью конфокальной макроскопии
Summary
During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.
Abstract
Во постнатального развития, незрелые клетки (гранулы возбуждающих интернейронов) демонстрируют тангенциальную миграцию во внешнем слое гранулированного, а затем радиальное перемещение в молекулярном слое и клеток Пуркинье слоя для достижения внутренний зернистый слой коры мозжечка. По умолчанию в миграционных процессах вызывает либо гибель клеток или потери нейронов, что приводит к дефициту в различных мозжечка функций. Центростремительное миграции ЗК включает в себя несколько механизмов, таких как хемотаксис и внеклеточной матрицы, деградации направлять клетки к их окончательной позиции, но факторы, которые регулируют миграцию клеток в каждом слое коры лишь частично известны. В нашем методе, острые кусочки мозжечка получают из P10 крыс, гранулы клетки метили флуоресцентным маркером цитоплазматической и ткани культивировали на мембранных вставками от 4 до 10 ч, прежде чем начать мониторинг в режиме реального времени миграции клеток с помощью конфокальной макроскопии при 37 ° С вНаличие CO 2. Во время их миграции в разных слоях коры мозжечка, ЗК могут подвергаться агонистов или антагонистов нейропептида, ингибиторы протеаз, блокаторы внутриклеточных эффекторов или даже токсичных веществ, таких как алкоголь или метилртути, чтобы исследовать их возможную роль в регуляции миграции нейронов ,
Introduction
В развивающихся мозжечка, восемь различных типов нейронов производятся последовательно между вторым эмбриональной недели и второй недели постнатального у грызунов 1. Возникнув первоначально из, первичной зародышевой зоне, незрелые ЗК (GC) Последние нейроны, чтобы быть получены от внешнего зернистого слоя (EGL), вторичного зародышевой зоне 2. В течение первых трех недель постнатального, мозжечковая кора расслаивается структура, организованная в четырех слоев, включая EGL, молекулярного слоя (МС), слой клеток Пуркинье (PCL) и внутренний зернистый слой (ИГЛ) (Рисунок 1). Через центростремительной миграции, незрелых ГК, глутаматергических интернейронов, достичь Igl в течение примерно 2 дней. К третьей недели постнатального, EGL исчезает и ИГЛ является то, что называется зернистый слой (GL) во взрослом мозжечке. В GL, ГК получить возбуждающие синаптические входы от замшелых волокон и униполярных кисти клеток, иингибирующие синаптические входы от клеток аксонов Гольджи. В ML, GC аксоны сделать возбуждающие синапсы с нейронами ГАМКергических в том числе клеток Пуркинье, корзины клеток, звездчатых клеток и клеток Гольджи 2.
В режиме реального времени наблюдение движения клеток мозжечка при острых срезов, полученных от раннего постнатального грызунов показывает, что ГК изменить свою форму одновременно с изменением модальности и скорости миграции во время их пути в коре мозжечка 3. Во первых двух послеродовых недель, предшественники GC активно размножаются в верхней части EGL. В средней части EGL, постмитотическими ГК мигрировать касательной в направлении их большей процесса. На границе EGL-ML, ГК замедлить их движение, клетки начинают вводить короткие вертикальные процесс нисходящей в ML. В ML, ГК имеют вертикально вытянутую тело клетки, тонкий процесс косую и более объемный процесс, ведущий, и мигрируют радиально вдоль глиальных волокон Бергмана. ВPCL, ГК остановить их движение, но после длительного стационарного этапа (2 ч), они пересекают границу PCL-Igl. В IGL, ГКС мигрировать к нижней части слоя в отсутствие глиальных поддержки волокна. После того, как кончики ведущего процесса подходить ИГЛ-белое вещество (WM) границы, ГК медленно и остановить их движение. Поперечные сечения мозжечка являются предпочтительными для касательных миграции исследований в то время как EGL сагиттальной ломтиками, посвященный радиальным миграции в ML, PCL и IGL. Некоторые регуляторные факторы движений ГК в том числе нейропептидов (например, соматостатин, РАСАР) были определены до сих пор, но полных механизмов, участвующих в пространственно-временной контроль ГК миграции в каждом слое коры еще в значительной степени неизвестны 1,4,5,6.
ГК миграция была изучена в течение последних 20 лет через видео- и конфокальной микроскопии с использованием либо проходящего света освещение для изолированных культивируемых клеток или флуоресцентной детекции для АМКУТе мозжечка ломтиками. Первоначально липофильные DiI, и в последнее время "Сотовый трекер" красители и клеточные выразил флуоресцентные белки были использованы для конфокальной или двухфотонного микроскопии 7,8. Успешные эксперименты зависеть от ряда конкретных процедур, которые делают простой протокол, но не так просто. В частности, острые кусочки должны быть стабилизированы при наблюдениях как правило, с самодельной нейлона ячеистой сети 9. Интенсивность света освещения должен быть как можно более низкой, чтобы избежать фототоксичность и фотообесцвечивания, предложенный сканирования многоточечной конфокальной микроскопии подхода. Кроме того, температура и CO 2 являются ключевыми параметрами окружающей среды начиная с нестабильностью могут повлиять на миграцию нейронов. Для облегчения и уточнения экспериментальных процедур, мы разработали конфокальной макроскопии протокол, который ограничивает движения ломтик, обеспечивает постоянные параметры окружающей среды, уменьшает фотообесцвечивание, увеличивает поле зрения (порядка миллиметров) и consequмому количество клеток (десятки), которые могут быть отслежены с помощью анализа изображений. Таким образом, 180 мкм срезы толщиной культивируют на мембранных вставками, и 6-луночные планшеты передается непосредственно под моторизованной цели 2X коммерческого конфокальной Макроскоп оснащен большим инкубации камеры, температуры и СО 2 контроллеров и системы контроля вибрации. Время проходит, а-Z-стеки затем выполняется в течение нескольких часов и фармакологических средств или биологически активные молекулы могут быть добавлены или доставлены в среде инкубации. Этот метод также может быть адаптирован для изучения миграции других типов нейронов в мозжечке или головного мозга на разных стадиях развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает культуру острых P10 мозжечка крысы ломтиками в системе Transwell и флуоресцентного мечения GC с зеленым флуоресцентным красителем для изучения миграции клеток во время постнатального развития через конфокальной макроскопии. Этот протокол позволяет наблюдения миграции клеток на срок до 12 часов и тестирования возможных ролей регулирования факторы в миграции, включая агонисты или антагонисты нейропептидов, ингибиторы ферментов, клеточных сигнальных модуляторов или токсичных веществ во время эксперимента. Небольшое отверстие в мембранной вставкой с кончика пипетки необходимо упростить администрирование соединений в среде инкубации. Самодельные изогнутые пипетки могут быть использованы для облегчения доставки раствора.
Одна проблема миграции клеток исследований на живых срезах тканей является то, что движения самой ткани может сделать отслеживание трудно клеток. В то время как прежние подходы предложили мягко стабилизации SLICES с нейлоновой сеткой или тонкий слой коллагена хвоста крысы 7,17, основным преимуществом этой технологии является простой и прямой передача культуры пластины 6-а, содержащий мозжечка ломтики на мембранных вставками из СО 2 инкубаторе в цели конфокального Макроскоп. Контроллеры Интегрированная температуры и СО 2 также обеспечивают надлежащие и постоянные экологические параметры, необходимые для миграции клеток 9. Таким образом, условия культивирования хранятся при наблюдениях и движений тканей к минимуму, так как кусочки хорошо прикреплен к мембранной вставки. Стабилизация ткани проверяется следующее положение среза краев или клеток Пуркинье, которые должны быть зафиксированы ссылки во время сбора. Кроме того, мозжечка ломтиками (между 12 и 18), распределенных в 6 лунках планшета можно быстро наблюдается подробно с моторизованным этапе и оптическим зумом. Из-за большого рабочего расстояния (x2, 39 мм) в сухом цели, эпи-observation свободен от погружения и введения соединений в культуральной среде гораздо проще. Таким образом, экологические параметры и поддержки культуры сходства в СО 2 инкубаторе и конфокальной макроскопии привести к максимальному сохранению биологического образца.
Еще одним преимуществом протокола является большое поле зрения и, следовательно, большое количество ячеек, которые можно наблюдать одновременно. Например, мы уже определили, что плотность люминесцентных ГК с радиальным миграции в 1124 мл ± 138 клеток / мм 2 18. Конфокальной макроскопии (Х2, NA = 0,234) имеет нижний боковой разрешение по сравнению с конфокальной микроскопии (40х, NA = 1,25), но клетки тела ГК может быть легко отслеживаются и средняя скорость миграции сопоставимы между двух технологических подходов 7,18 ,
Кроме того, для технического совершенствования приобретений изображения, качество срезов тканей и гоE Качество маркировки являются ключевыми точками для успешных экспериментов. Всегда держите СМИ и тканей на льду во время вскрытия процессов, устранения нефть на vibratome лопаток и не использовать ломтики ткани в контакте с клеем. Сагиттальной и поперечные срезы приспособлены к радиальным и тангенциальным миграции соответственно. Использование различных длин инкубации в течение соответствующего обнаружения в различных слоях коры мозжечка. Длительное время инкубации (до 8 часов) необходимы для обнаружения миграции многочисленных ГК в PCL и IGL. С ГК миграция физиологический процесс в определенные пространственно-временных окон, положительный контроль является то, что клетки должны мигрировать должным образом. В частности, многочисленные шпинделя ГК в ML является одной из основной показатель здоровья для сагиттальной мозжечка ломтиками. Для запуска эксперименты, наблюдения движений GC в МЛ предложил. Действительно, форма GC с вертикально удлиненный корпус клеток следует рассматривать в качестве точки отсчета, чтобы начать переменногоприобрете- с последовательным контролем (2 ч) и лечения (2 ч) периоды, которые могут быть легко выполнены в ML.
Флуоресцентные красители, такие как семейства сотовый Tracker или флуоресцирующих белков, выраженных через генетических конструкций могут быть использованы в качестве индикаторов для миграции клеток исследований. Из-за медленной кинетике GC миграции (1 стека каждые 30 мин), многоцветные эксперименты также могут быть выполнены в последовательном режиме, так как 4 лазеров лучей (405, 488, 532 и 633 нм) доступны в системе. Учитывая центростремительной и центробежной радиальную миграцию, отслеживание других интернейронов также могут быть реализованы 18. В частности, за вычетом многочисленные типы клеток могут быть более легко локализованы с большим полем зрения. Наконец, этот протокол может быть использован для изучения миграции клеток на других этапах развития мозжечка, но и других областей мозга.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Институтом исследований и инноваций в биомедицине (IRIB), в ячейки изображения платформе Нормандии (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, Университета Руана, Европейского фонда регионального развития (ЕФРР – Перене, Интеррег 4А), ЛАРК-нейронаук Сеть и регионе Верхняя Нормандия.
Materials
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| Hank's balanced salt solution 10X | Sigma-Aldrich | H1641 | |
| PACAP38 | INRS, Canada | Bourgault et al., 200919 | |
| PAI-1 | Calbiochem | 528208 | |
| N-2 supplement | Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen | O973 | |
| cyanoacrylate glue | Loctite | ||
| Cell Tracker Green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Polyester Transwell-Clear inserts | Corning | 3452 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| 6-well cell culture cluster | Corning | 3516 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Tissue culture dish 35 mm diameter | BD Falcon | 353004 | |
| Tissue culture dish 100 mm diameter | Thermo SCIENTIFIC | 130182 | |
| Polypropylen tube (15 ml) | BD Falcon | 352096 | |
| Ethanol 70% | Fisher Chemical | E/0800DF/21 | |
| biological safety cabinet fume hood | Thermo Scientific | MSC9 Class II A2 | |
| adjustable-volume pipette (0,5-10 µL) | Eppendorf | 4910 000.018 | |
| gyro-rocker, SSL3 | Stuart | ||
| CO2 incubator, Hera Cell 150 | Thermo Scientific | ||
| vibrating blade microtome, VT1000S | Leica Microsystems | ||
| confocal macroscope, TCS LSI | Leica Microsystems | ||
| temperature controller | PeCon | ||
| CO2-controller | PeCon | ||
| Stereomicroscope, M205 C | Leica Microsystems | ||
| Operating scissors, curved, blunt/blunt | Medicon | 03.03.17 | |
| Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp | FST | 149090-11 | |
| Dumont #3 and #5 forceps | FST | 11293-00 and 11252-20 | |
| Vibratome injector blades/single edge | Leica Microsystems | 39053250 | |
| standard scalpel handle #3 solid | FST | 10003-12 | |
| surgical blade #15 | Swann-Morton | 205 |
References
- Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. Migration in the Cerebellum. Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Komuro, H., Rakic, P. Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex. Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).
- Komuro, H., Yacubova, E. Recent advances in cerebellar granule cell migration. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).
- Fahrion, J. K., et al. Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).
- Raoult, E., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).
- Cameron, D. B., et al. Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).
- Renaud, J., et al. Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells. Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).
- Komuro, H., Rakic, P. Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations. Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).
- Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex. Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).
- Hannibal, J. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).
- Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones. Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).
- Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration. Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).
- Friedman, G. C., Seeds, N. W. Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum. Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).
- Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding. Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).
- Basham, M. E., Seeds, N. W. Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain. Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).
- Bourgault, S., et al. Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor. Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).
