فيفو السابقين التصوير من بعد الولادة مخيخي الحبيبة الهجرة الخلية باستخدام متحد البؤر الفحص العياني
Summary
During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.
Abstract
أثناء التطور بعد الولادة، الخلايا الحبيبية غير ناضجة (interneurons مثير) يحمل الهجرة عرضية في الطبقة الحبيبية الخارجية، والهجرة ثم شعاعي في طبقة الجزيئية وطبقة الخلايا العصبية للوصول إلى الطبقة الحبيبية الداخلية للقشرة المخ. الافتراضي في عمليات الهجرة يدفع إما موت الخلايا أو في غير موضعها من الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى عجز في وظائف المخيخ متنوعة. تتضمن الجاذبية هجرة الخلايا الحبيبية عدة آليات، مثل الكيميائي وتدهور المصفوفة خارج الخلية، لتوجيه الخلايا نحو موقفهم النهائي، ولكن لا يعلمها إلا جزئيا العوامل التي تنظم الهجرة خلية في كل طبقة قشرية. في أسلوبنا، يتم إعداد شرائح للدماغ الحادة من P10 الفئران، وصفت الخلايا الحبيبية مع علامة حشوية الفلورسنت والأنسجة ومثقف على إدراج غشاء 4-10 ساعة قبل بدء رصد في الوقت الحقيقي من الهجرة الخلية عن طريق الفحص العياني متحد البؤر عند 37 درجة مئوية فيوجود CO 2. أثناء هجرتها في الطبقات القشرية مختلفة من المخيخ، والخلايا الحبيبية يمكن أن يتعرض لمنبهات نيوروبيبتيدي أو الخصوم، مثبطات الأنزيم البروتيني، حاصرات من المؤثرات داخل الخلايا أو المواد السامة حتى مثل الكحول أو ميثيل الزئبق للتحقيق في دور محتمل في تنظيم الهجرة العصبية .
Introduction
في المخيخ النامية، ثمانية أنواع مختلفة من الخلايا العصبية تنتج بالتسلسل بين الأسبوع الجنينية الثاني والأسبوع الثاني بعد الولادة في القوارض 1. تنشأ في البداية من، منطقة جرثومي الأولية، الخلايا الحبيبية غير ناضجة (GC) هي الخلايا العصبية الماضية إلى أن يتم إنتاجها من طبقة خارجية الحبيبية (EGL)، منطقة جرثومي ثانوي 2. خلال ثلاثة أسابيع بعد الولادة الأولى، وقشرة المخيخ هو بنية رقي نظمت في أربع طبقات بما في ذلك EGL، وطبقة الجزيئية (ML)، وطبقة الخلايا العصبية (PCL) والطبقة الحبيبية الداخلية (IGL) (الشكل 1). من خلال الهجرة الجاذبية، غير ناضج GCS، interneurons glutamatergic، وصول إلى IGL غضون ما يقرب من 2 يوما. في الأسبوع ما بعد الولادة الثالث، وEGL يختفي ويشكل IGL ما يسمى الطبقة الحبيبية (GL) في المخيخ الكبار. في GL، GCS حصول على مدخلات متشابك مثير من الألياف المطحلب والخلايا فرشاة القطب الواحد، ومدخلات متشابك المثبطة من محاور الخلايا جولجي. في ML، المحاور GC تجعل نقاط الاشتباك العصبي مثير مع الخلايا العصبية GABAergic بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا سلة، والخلايا النجمية، والخلايا جولجي 2.
مراقبة الوقت الحقيقي من حركة الخلايا في المخيخ شرائح الحادة التي تم الحصول عليها من القوارض بعد الولادة المبكرة يدل على أن GCS تعديل شكلها بالتزامن مع التغييرات في طريقة وسرعة الهجرة خلال طريقهم في قشرة المخ 3. خلال أول أسبوعين بعد الولادة، السلائف GC تتكاثر بنشاط في الجزء العلوي من EGL. في الجزء الأوسط من EGL، تالية للتفتل GCS الهجرة بشكل عرضي في اتجاه عملية أكبر بهم. على الحدود EGL-ML، GCS بطء حركتها، فإن الخلايا تبدأ في الدخول في عملية الهابطة عمودية قصيرة في ML. في ML، GCS لديها خلايا الجسم ممدود عموديا، وهي عملية زائدة رقيقة وعملية تؤدي أكثر ضخمة، وترحيل شعاعيا على طول الألياف الدبقية بيرجمان. فيPCL، GCS وقف حركتهم ولكن بعد مرحلة ثابتة لفترات طويلة (2 ساعة)، وعبور الحدود PCL-IGL. في IGL، GCS تهاجر نحو الجزء السفلي من طبقة في غياب الدعم الألياف الدبقية. مرة واحدة على نصائح من العملية المؤدية الاقتراب من الحدود مسألة IGL البيضاء (WM)، GCS بطيئة ووقف حركتهم. ويفضل المقاطع العرضية من المخيخ لدراسات الهجرة عرضية في EGL في الوقت الذي يكرسون شرائح السهمي إلى شعاعي الهجرة في ML، PCL وIGL. بعض العوامل التنظيمية للحركات GC بما في ذلك نيوروببتيد (على سبيل المثال، السوماتوستاتين، PACAP) تم التعرف حتى الآن ولكن آليات متكاملة تشارك في السيطرة المكانية والزمانية للهجرة GC في كل طبقة قشرية لا تزال 1،4،5،6 معروفة إلى حد كبير.
وقد تمت دراسة الهجرة GC خلال 20 عاما الماضية من خلال أشرطة الفيديو ومتحد البؤر المجهري باستخدام الإضاءة الخفيفة التي تنتقل عن الخلايا المستزرعة معزولة أو الكشف عن مضان لإبرةشرائح المخيخ الشركة المصرية للاتصالات. استخدمت الجاذبة للدهون في البداية، ومؤخرا "المقتفي خلية" الأصباغ وأعرب الخلية البروتينات الفلورية للمتحد البؤر أو اثنين من الفوتون المجهري 7،8. التجارب الناجحة تعتمد على عدد من الإجراءات المحددة التي تجعل من بروتوكول بسيطة ولكن ليس من السهل. على وجه الخصوص، شرائح الحادة يجب أن استقرت خلال الملاحظات بشكل عام مع النايلون شبكة شبكة محلية الصنع 9. شدة الإضاءة الخفيفة يجب أن تكون في أدنى مستوى ممكن لتجنب الضيائية وphotobleaching من النحو الذي اقترحه مسح متعددة نهج المجهر متحد البؤر. بالإضافة إلى ذلك، درجة الحرارة وCO 2 هي المعايير البيئية الرئيسية منذ عدم الاستقرار قد تؤثر هجرة الخلايا العصبية. لتسهيل وتحسين الإجراءات التجريبية، قمنا بتطوير بروتوكول الفحص العياني متحد البؤر التي تحد من تحركات شريحة، ويضمن المعايير البيئية المستمرة، ويقلل من photobleaching من، ويزيد من مجال الرؤية (بناء على أمر من مليمتر) وconsequمستديم عدد الخلايا (عشرات) التي يمكن تتبعها من خلال تحليل الصور. وهكذا، 180 ميكرون شرائح سميكة يتم تربيتها على إدراج الغشاء، ويتم نقل 6 لوحات جيدا مباشرة تحت هدف 2X بمحرك من macroscope متحد البؤر التجارية مجهزة حضانة كبيرة الغرفة ودرجة الحرارة وCO 2 وحدات التحكم ونظام التحكم في الاهتزاز. ثم يتم تنفيذ الوقت الهفوات وض مداخن على مدى عدة ساعات وأدوات الدوائية أو الجزيئات النشطة بيولوجيا يمكن إضافة أو تسليمها في المتوسط الحضانة. ويمكن أيضا أن هذا الأسلوب يمكن تكييفها لدراسة هجرة أنواع أخرى من الخلايا العصبية في المخيخ أو المخ في مراحل النمو المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول ثقافة الفئران P10 شرائح للدماغ الحادة في النظام Transwell ووضع العلامات الفلورية من GC مع صبغة الفلورسنت الأخضر لدراسة الهجرة الخلية أثناء التطور بعد الولادة من خلال الفحص العياني متحد البؤر. هذا البروتوكول يسمح الملاحظات للهجرة الخلايا لمدة تصل إلى 12 ساعة واختبار الأدوار المحتملة لتنظيم العوامل في الهجرة بما في ذلك منبهات أو الخصوم من نيوروببتيد، مثبطات الإنزيم، مما يشير إلى خلية جهري أو المواد السامة أثناء التجربة. ثقب صغير في إدراج الغشاء مع طرف ماصة ضروري لتسهيل إدارة المركبات في المتوسط الحضانة. ويمكن استخدام المنحنية غيض ماصة محلية الصنع لتسهيل إيصال الحل.
قضية واحدة من دراسات الهجرة الخلية الحية على شرائح الأنسجة هي أن تحركات الأنسجة نفسها يمكن أن تتبع الخلية الصعبة. في حين اقترح النهج السابقة لتحقيق الاستقرار بلطف سليالمجال الاقتصادي الموحد مع النايلون شبكة أو طبقة رقيقة من ذيل فأر الكولاجين 7،17، والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو نقل بسيطة ومباشرة من لوحة الثقافة 6 جيدا تحتوي على شرائح للدماغ على إدراج غشاء من الحاضنة CO 2 في إطار الهدف من macroscope متحد البؤر. كما توفر درجة الحرارة متكاملة وCO 2 وحدات التحكم العوامل البيئية المناسبة والمستمرة ضرورية لهجرة الخلية 9. لذلك، يتم الاحتفاظ الظروف والثقافة خلال الملاحظات والحركات الأنسجة إلى أدنى حد ممكن حيث أن تعلق شرائح جيدا لإدراج الغشاء. يتم التحقق من استقرار النسيج باتباع موقف حواف شريحة أو الخلايا العصبية التي ينبغي أن تكون ثابتة مراجع خلال الاستحواذ. بالإضافة إلى ذلك، شرائح للدماغ (بين 12 و 18) وزعت في 6 آبار من لوحة يمكن ملاحظة بسرعة بالتفصيل مع مرحلة الآلية وزووم بصري. نظرا لبعد المسافة الكبيرة العاملة (X2، 39 مم) هدف الجاف، وبرنامج التحصين الموسع-observation خالية من الغمر وإدارة المركبات في مستنبت هو أسهل من ذلك بكثير. ولذلك، المعايير البيئية والتشابه لدعم الثقافة في CO 2 الحاضنة ومتحد البؤر الفحص العياني يؤدي إلى الحفاظ على الحد الأقصى من العينة البيولوجية.
ميزة أخرى للبروتوكول في مجال واسع من الرأي، وبالتالي عدد كبير من الخلايا التي يمكن ملاحظتها في وقت واحد. على سبيل المثال، فقد قررنا سابقا أن كثافة GCS الفلورسنت مع الهجرة شعاعي في ML كان 1124 ± 138 خلية / ملم 2 18. الفحص العياني متحد البؤر (X2، NA = 0.234) لديه دقة أقل الجانبي مقارنة متحد البؤر المجهري (40X، NA = 1.25) ولكن الخلية يمكن تتبع جثث GCS بسهولة ومتوسط سرعة الهجرة غير قابلة للمقارنة بين تقترب من التكنولوجية اثنين 7،18 .
إلى جانب تحسن التقنية للقيام بعمليات استحواذ الصورة، ونوعية من شرائح الأنسجة والعشرينجودة (ه) من العلامات هي النقاط الرئيسية للتجارب الناجحة. دائما وسائل الاعلام والأنسجة على الجليد أثناء عمليات تشريح، والقضاء على النفط على vibratome شفرات ولا تستخدم شرائح من الأنسجة في اتصال مع الغراء. يتم تكييفها أقسام السهمي وعرضية لشعاعي والهجرة عرضية على التوالي. استخدام أطوال مختلفة من الحضانة للكشف المناسب في الطبقات القشرية مختلفة من المخيخ. أوقات طويلة الحضانة (تصل إلى 8 ساعات) ضرورية للكشف عن هجرة العديد من GCS في PCL وIGL. منذ الهجرة GC هي عملية فيزيولوجية خلال النوافذ المكانية والزمانية محددة، والسيطرة الإيجابية هي أن الخلايا لديها إلى الهجرة بشكل صحيح. على وجه الخصوص، العديد من GC المغزل في ML هي واحدة من المؤشرات الصحية الرئيسية لشرائح المخيخ السهمي. لبدء التجارب، ويقترح مراقبة تحركات GC في ML. في الواقع، ينبغي النظر في شكل GC مع ممدود عموديا خلايا الجسم كنقطة مرجعية لبدء ميلانquisition مع مراقبة متتالية (2 ساعة) والعلاج (2 ساعة) الفترات التي يمكن القيام بها بسهولة في ML.
الأصباغ الفلورية مثل عائلة تعقب خلية أو البروتينات الفلورية التعبير عنها من خلال بنيات وراثية ويمكن استخدام كأثر للدراسات الهجرة الخلية. ونظرا لحركية بطيئة للهجرة GC (1 كومة كل 30 دقيقة)، والتجارب متعدد الألوان ويمكن أيضا أن يؤديها في وضع متتابعة منذ 4 الليزر الحزم (405، 488، 532 و 633 نانومتر) متوفرة على النظام. وبالنظر إلى الجاذبية والطرد المركزي الهجرة شعاعي، وتتبع من interneurons أخرى يمكن أيضا أن تتحقق 18. على وجه الخصوص، وأقل أنواع الخلايا عديدة يمكن أن تكون مترجمة أكثر سهولة مع حقل كبير للعرض. أخيرا، هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة الهجرة الخلية في مراحل أخرى من تطوير للدماغ ولكن أيضا مناطق الدماغ الأخرى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد للبحوث والابتكار في الطب الحيوي (IRIB)، ومنهاج التصوير خلية من نورماندي (PRIMACEN)، INSERM، IBiSA، وجامعة روان، الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (ERDF – PeReNE، الأقاليمي 4A)، وLARC-العصبية شبكة والمنطقة هوت نورماندي.
Materials
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| Hank's balanced salt solution 10X | Sigma-Aldrich | H1641 | |
| PACAP38 | INRS, Canada | Bourgault et al., 200919 | |
| PAI-1 | Calbiochem | 528208 | |
| N-2 supplement | Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen | O973 | |
| cyanoacrylate glue | Loctite | ||
| Cell Tracker Green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Polyester Transwell-Clear inserts | Corning | 3452 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| 6-well cell culture cluster | Corning | 3516 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Tissue culture dish 35 mm diameter | BD Falcon | 353004 | |
| Tissue culture dish 100 mm diameter | Thermo SCIENTIFIC | 130182 | |
| Polypropylen tube (15 ml) | BD Falcon | 352096 | |
| Ethanol 70% | Fisher Chemical | E/0800DF/21 | |
| biological safety cabinet fume hood | Thermo Scientific | MSC9 Class II A2 | |
| adjustable-volume pipette (0,5-10 µL) | Eppendorf | 4910 000.018 | |
| gyro-rocker, SSL3 | Stuart | ||
| CO2 incubator, Hera Cell 150 | Thermo Scientific | ||
| vibrating blade microtome, VT1000S | Leica Microsystems | ||
| confocal macroscope, TCS LSI | Leica Microsystems | ||
| temperature controller | PeCon | ||
| CO2-controller | PeCon | ||
| Stereomicroscope, M205 C | Leica Microsystems | ||
| Operating scissors, curved, blunt/blunt | Medicon | 03.03.17 | |
| Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp | FST | 149090-11 | |
| Dumont #3 and #5 forceps | FST | 11293-00 and 11252-20 | |
| Vibratome injector blades/single edge | Leica Microsystems | 39053250 | |
| standard scalpel handle #3 solid | FST | 10003-12 | |
| surgical blade #15 | Swann-Morton | 205 |
References
- Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. Migration in the Cerebellum. Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Komuro, H., Rakic, P. Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex. Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).
- Komuro, H., Yacubova, E. Recent advances in cerebellar granule cell migration. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).
- Fahrion, J. K., et al. Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).
- Raoult, E., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).
- Cameron, D. B., et al. Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).
- Renaud, J., et al. Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells. Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).
- Komuro, H., Rakic, P. Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations. Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).
- Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex. Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).
- Hannibal, J. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).
- Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones. Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).
- Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration. Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).
- Friedman, G. C., Seeds, N. W. Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum. Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).
- Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding. Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).
- Basham, M. E., Seeds, N. W. Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain. Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).
- Bourgault, S., et al. Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor. Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).
