Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme
Summary
During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.
Abstract
Doğum sonrası gelişimi sırasında, olgunlaşmamış granül hücreleri (eksitatör internöron) serebellar korteksin iç granüler tabaka ulaşmak için moleküler tabaka ve Purkinje hücre tabakası dış granüler tabakasında teğet göç ve ardından radyal göç gösterirler. Göç süreçlerinde Standart çeşitli serebellar fonksiyonları açıklarına yol hücre ölümü ya da nöronların risklerinin ya uyarır. Merkezcil granül hücre göçü nihai konumuna doğru hücreleri yönlendirmek için böyle kemotaksisinin ve hücre dışı matriks bozulması gibi çeşitli mekanizmalar, içerir, ancak her kortikal katmanda hücre göçü düzenleyen faktörler sadece kısmen bilinmektedir. Bizim yöntemde, akut serebral dilimleri P10 sıçan hazırlanır, granül hücreleri fluoresan bir sitoplazmik bir işaretleyici ile etiketlenir ve dokular 37 ° C'de konfokal makroskopi hücre göçünün gerçek zamanlı izleme başlamadan önce 4 ila 10 saat membran ekler üzerinde kültürlenmiştir içindeCO 2 varlığı. Beyincik farklı kortikal tabakalar halinde kendi göç sırasında, granül hücrelerinin nöronal göç düzenlenmesinde olası rolünü araştırmak için nöropeptid agonistleri veya antagonistleri, proteaz inhibitörleri, hücre içi efektörlerinin veya alkol ya da Methylmercury bile toksik maddelerin bloker maruz kalabilir .
Introduction
Gelişmekte olan beyincik, nöron sekiz farklı tipte ikinci embriyonik haftada ve kemirgenler 1 ikinci doğum sonrası hafta arasında sırayla üretilmektedir. Başlangıçta birincil germinal bölge hareketle, olgun olmayan granül hücreleri (GC), dış granüler tabaka (EGL), ikinci bir germinal bölge 2 üretilebilir son nöronlardır. İlk üç sonrası hafta boyunca, serebellar korteks EGL, moleküler tabakanın (ML) dahil olmak üzere dört katman olarak düzenlenen bir yapraklanmış bir yapıdır, Purkinje hücresi tabakası (PCL) ve iç granüler tabaka (IGL) (Şekil 1). Merkezcil göç, olgunlaşmamış GC'ler, glutamaterjik internöronların sayesinde, yaklaşık 2 gün içinde Igl ulaşır. Üçüncü doğum sonrası haftasında, EGL kaybolur ve IGL yetişkin beyincik granüler tabaka (GL) ne denir oluşturmaktadır. GL, GC'ler yosunlu elyaf ve unipolar fırça hücrelerinden eksitatör sinaptik girişleri alabilir veGolgi hücre aksonlarından inhibitör sinaptik girdiler. ML ise, GC aksonları Purkinje hücreleri, sepet hücreleri, stellat hücreler ve golgi hücrelerinin 2 olmak üzere GABAerjik nöronlar ile sinaps eksitatör yapmak.
Erken doğum sonrası kemirgenler elde edilen akut serebellar dilimleri içinde hücre hareketi Gerçek zamanlı gözlem GC'ler serebellar korteks 3 onların rota boyunca göç yöntemi ve hız değişiklikleri ile eş zamanlı olarak kendi şeklini değiştirmek olduğunu göstermektedir. İlk iki doğum sonrası hafta boyunca, GC öncüleri aktif EGL üstündeki çoğalır. EGL orta kısmında, postmitotic GC'ler onların büyük sürecinde yönünde teğet göç ederler. EGL-ML sınırında, GC'ler onların hareketlerini yavaş hücreler ML içine kısa dikey inen sürecine girmeye başlar. ML yılında GC'ler dikey uzatılmış hücre gövdesi, ince firar süreci ve daha hacimli lider süreci ve Bergmann glial lifleri boyunca radyal göç. IçindePCL, GC'ler kendi hareketini durdurmak ama uzun bir sabit faz (2 saat) sonra, onlar PCL-IGL sınırını geçmeye. Igl yılında GC'ler glial lif desteğinin yokluğunda tabakasının altına doğru göç ederler. Giden süreçte uçları kez IGL-beyaz cevher (WM) sınır, GC'ler yavaş yaklaşmak ve onların hareketini durdurun. Sagital dilim ML, PCL ve Igl göçü radyal adanmıştır ise beyincik enine kesitler EGL de teğet göç çalışmaları için tercih edilmektedir. (Örneğin, somatostatin, PACAP) şimdiye kadar tespit edilmiştir nöropeptid ancak her kortikal katmanda GC göç uzay-zamansal kontrolünde yer alan komple mekanizmalar da dahil olmak üzere GC hareketlerinin bazı düzenleyici faktörler hala büyük ölçüde bilinmeyen 1,4,5,6 vardır.
GC göç acu için izole kültürlü hücreleri veya floresan tespiti için ya iletilen ışık aydınlatma kullanarak video ve konfokal mikroskopi sayesinde son 20 yılda çalışılmıştırte serebellar dilimleri. Başlangıçta lipofilik DII ve son zamanlarda "Hücre Takibi" boyalar ve hücre-ifade floresan proteinleri konfokal ya da iki-fotonlu mikroskopi 7,8 kullanılmıştır. Başarılı deneyler protokol basit ama kolay değil yapmak belirli prosedürlerin sayısına bağlıdır. Özellikle, akut dilimler bir ev yapımı naylon örgü ağı 9 genellikle gözlem sırasında stabilize edilmesi gerekir. ışık aydınlatma şiddeti çoklu tarama konfokal mikroskop yaklaşım tarafından önerilen fototoksisite ve photobleaching önlemek için mümkün olduğunca düşük olması gerekir. Buna ek olarak, sıcaklık ve CO2 nöronal göç etkileyebilir istikrarsızlık beri önemli çevresel parametrelerdir. Kolaylaştırmak ve deneysel prosedürleri rafine etmek, biz, dilim hareketlerini sınırlayan sabit çevre parametreleri sağlar, photobleaching azaltır ve consequ (milimetre mertebesinde) görüş alanını artıran bir konfokal makroskopi protokolü geliştirdikgörüntü analizi yoluyla izlenebilir hücreleri (onlarca) sayısını isteğinizle. Bu durumda, 180 mikron kalınlığında kesitler membran ekler üzerinde kültürlenmiştir ve 6 oyuklu plakalar doğrudan büyük bir inkübasyon odası, sıcaklık ve CO2 kontrolör ve bir sarsıntı kontrol sistemi ile donatılmış bir ticari konfokal macroscope bir 2X objektif altında motorlu aktarılır. Zaman zaman aşımına uğrar ve z-yığınlarının daha sonra birkaç saat ve farmakolojik araçlar üzerinden gerçekleştirilir ya da biyolojik olarak aktif moleküllerin ilave ya da kuluçka ortamı içinde verilebilir. Bu yöntem, aynı zamanda, farklı gelişim aşamalarında serebellum ya da beyin nöron diğer tiplerinin hareketini incelemek için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol Transwell sistemi ve konfokal makroskopi yoluyla doğum sonrası gelişimi sırasında hücre göçü incelemek için yeşil floresan boya ile GC floresan etiketleme akut P10 sıçan serebellar dilim kültürü anlatılmaktadır. Bu protokol, 12 saat ve deney sırasında agonistleri veya nöropeptid antagonistler, enzim inhibitörler, hücre sinyal modülatörlerinin veya toksik maddeler de dahil olmak üzere göç faktörlerin düzenlenmesinde olası rollerinin testine kadar bir süre için, hücre göçünün gözlemler sağlar. Bir pipet ucu ile membran geçme küçük bir delik, kuluçkalama ortamı içinde bileşiklerin uygulanmasını kolaylaştırmak için gereklidir. Bir ev yapımı kavisli uç pipet çözeltisi iletimini kolaylaştırmak için kullanılabilir.
Doku dilimleri canlı hücre göçü çalışmalardan biri sorunu dokusunun kendisi hareketleri hücre zor izleme yapabilirsiniz olmasıdır. Önceki yaklaşımlar hafifçe SLI stabilize etmek için önerdi OysaBir naylon ces mesh veya fare kuyruk kolajeni 7,17 ince bir tabaka, bu teknolojinin büyük bir avantaj hedefi altında CO2 inkübatör membran ekler serebellar dilim içeren bir 6-yuvalı kültür plakasının basit ve doğrudan transferi konfokal macroscope evi. Entegre sıcaklık ve CO 2 kontrolörleri de hücre migrasyonu 9 için gerekli uygun ve sabit çevre parametreleri sağlamak. Bu nedenle, kültür koşulları dilimleri de zar insert bağlı beri en aza indirilmiştir gözlemler ve doku hareketleri sırasında tutulur. Doku stabilizasyonu edinimi sırasında referanslar sabit olmalıdır dilim kenarları veya Purkinje hücrelerinin konumunu takip tarafından doğrulanmadı. Buna ek olarak, plaka 6 kuyucuklarına dağıtılmış ve serebellar dilimleri (12 ila 18), hızlı bir şekilde, bir motorlu kaide ile bir optik zoom ile ayrıntılı olarak görülmektedir. Nedeniyle kuru hedefi, epi büyük çalışma mesafesi (X2, 39 mm)Kültür ortamı daha kolay olarak * Gözlem bileşiklerinin daldırma ve uygulama imkanı mevcuttur. Bu nedenle, CO 2 kuvöz ve konfokal çevre parametreleri ve kültür destek benzerlikler biyolojik numune maksimum koruma yol makroskopi.
Protokol diğer bir avantajı, büyük görüş alanı ve aynı zamanda görülebilir hücre dolayısıyla büyük bir sayıdır. Örneğin, daha önce ML radyal göç floresan GC'ler yoğunluğu 1124 ± 138 hücre / mm 2 18 olduğunu tespit ettik. Konfokal Makroskopi (X2, NA 0,234 =) konfokal mikroskobu ile karşılaştırıldığında daha düşük bir yan çözünürlüğe sahip (40X NA = 1.25), ancak iki teknolojik 7,18 yaklaşır arasındaki hücre GClerin organları kolaylıkla takip edilebilir ve göç ortalama hızı karşılaştırılabilir .
Görüntü satın almalar, doku dilimleri ve th kalitesi için teknik gelişme yanındaetiketleme e kalitesi başarılı deneyler için kilit noktalarıdır. Her zaman diseksiyon süreçlerinde buz üzerinde medya ve dokuları korumak, vibratome bıçaklar yağ ortadan kaldırmak ve tutkal ile temas doku dilimleri kullanmak yok. Sagital ve enine kesitler sırasıyla radyal ve teğet göç adapte edilir. Serebellumun farklı kortikal katmanları uygun tespiti için inkübasyon farklı uzunluklara kullanın. (8 saat kadar) uzun inkübasyon süreleri, PCL ve Igl çok sayıda GClerin geçişini tespit etmek için gereklidir. GC göç özgü uzay-zamansal pencereleri sırasında fizyolojik süreç olduğundan, pozitif kontrol hücreleri düzgün göç etmek zorunda olmasıdır. Özellikle, ML çok sayıda aks GC sajital serebellar dilimleri için başlıca sağlık göstergesi biridir. Deney çalıştırmak için, ML GC hareketlerinin izlenmesi önerilmiştir. Gerçekten de, dikey olarak uzatılmış hücre gövdesi ile GC şekli, AC başlatmak için bir referans noktası olarak göz önüne alınmalıdırbirbirini takip eden kumanda (2 saat) ve tedavi (2 saat) kolayca ML yapılabilir dönemlerle edinirken.
Hücre Tracker aile ya da genetik yapıları aracılığıyla ifade floresan proteinleri gibi Floresan boyalar hücre göçü çalışmaları için izleyiciler olarak kullanılabilir. Nedeniyle GC göç (1 yığın her 30 dk) yavaş kinetiği için, renkli deneyler de sistemde 4 lazerler kiriş (405, 488, 532 ve 633 nm) beri sıralı modunda kullanılabilir olan yapılabilmektedir. Diğer internöronlar izleme, merkezcil ve merkezkaç radyal göç dikkate alındığında da 18 gerçekleştirilebilir. Özellikle, daha az sayıda hücre tipi daha kolay geniş bir görüş alanı ile lokalize edilebilir. Son olarak, bu protokol, serebellar gelişme için diğer aşamalarında değil, aynı zamanda diğer beyin bölgelerinde hücre göçü incelemek için kullanılabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
– (PeReNE, Interreg 4A ERDF) Bu çalışma Biyotıp Araştırma ve Yenilik Enstitüsü (IRIB), Normandiya Hücre Görüntüleme Platformu (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, Rouen Üniversitesi, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu tarafından desteklenen LARC-Nörobilim Ağ ve Région Haute-Normandie.
Materials
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| Hank's balanced salt solution 10X | Sigma-Aldrich | H1641 | |
| PACAP38 | INRS, Canada | Bourgault et al., 200919 | |
| PAI-1 | Calbiochem | 528208 | |
| N-2 supplement | Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen | O973 | |
| cyanoacrylate glue | Loctite | ||
| Cell Tracker Green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Polyester Transwell-Clear inserts | Corning | 3452 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| 6-well cell culture cluster | Corning | 3516 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Tissue culture dish 35 mm diameter | BD Falcon | 353004 | |
| Tissue culture dish 100 mm diameter | Thermo SCIENTIFIC | 130182 | |
| Polypropylen tube (15 ml) | BD Falcon | 352096 | |
| Ethanol 70% | Fisher Chemical | E/0800DF/21 | |
| biological safety cabinet fume hood | Thermo Scientific | MSC9 Class II A2 | |
| adjustable-volume pipette (0,5-10 µL) | Eppendorf | 4910 000.018 | |
| gyro-rocker, SSL3 | Stuart | ||
| CO2 incubator, Hera Cell 150 | Thermo Scientific | ||
| vibrating blade microtome, VT1000S | Leica Microsystems | ||
| confocal macroscope, TCS LSI | Leica Microsystems | ||
| temperature controller | PeCon | ||
| CO2-controller | PeCon | ||
| Stereomicroscope, M205 C | Leica Microsystems | ||
| Operating scissors, curved, blunt/blunt | Medicon | 03.03.17 | |
| Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp | FST | 149090-11 | |
| Dumont #3 and #5 forceps | FST | 11293-00 and 11252-20 | |
| Vibratome injector blades/single edge | Leica Microsystems | 39053250 | |
| standard scalpel handle #3 solid | FST | 10003-12 | |
| surgical blade #15 | Swann-Morton | 205 |
References
- Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. Migration in the Cerebellum. Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Komuro, H., Rakic, P. Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex. Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).
- Komuro, H., Yacubova, E. Recent advances in cerebellar granule cell migration. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).
- Fahrion, J. K., et al. Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).
- Raoult, E., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).
- Cameron, D. B., et al. Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).
- Renaud, J., et al. Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells. Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).
- Komuro, H., Rakic, P. Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations. Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).
- Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex. Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).
- Hannibal, J. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).
- Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones. Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).
- Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration. Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).
- Friedman, G. C., Seeds, N. W. Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum. Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).
- Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding. Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).
- Basham, M. E., Seeds, N. W. Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain. Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).
- Bourgault, S., et al. Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor. Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).
