Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Desenvolvimento tradicional vacina tem utilizado, principalmente, a abordagem empírica de tentativa-e-erro. No entanto, com o recente desenvolvimento de uma grande variedade de biomateriais e descoberta de determinantes moleculares de activação imunitária, é agora possível conceber racionalmente formulações de vacinas com pistas biofísicas e bioquímicas derivados de patogénios ^1,2. Em particular, várias plataformas de entrega de droga de partículas foram examinados como transportadores de vacinas uma vez que podem ser co-carregadas com antigénios de subunidade e agentes imunoestimulantes, proteger os componentes da vacina contra a degradação, e aumentar a sua co-entrega a células apresentadoras de antigénio (APCs), residente em linfa nodos (LNs), maximizando assim a estimulação e activação imunitária ^3-5. Neste relatório, descreve-se a síntese de um sistema de nanopartículas "-imitando agente patogénico", denominados interbilayer reticulado vesículas multilamelares (ICMVs), que tenham sido previamente demonstrado como uma vacina potente Platform para elicitação de robusto de linfócitos T citotóxicos (CTL) e respostas imunitárias humorais em ambos os compartimentos dos tecidos das mucosas e sistémicas ^6-9. Em particular, a vacinação com ICMVs alcançado substancialmente melhorada níveis de IgG no soro contra um antigénio da malária, em comparação com a vacinação com adjuvantes convencionais (por exemplo, alúmen e Montanide ⁷⁾ e também induziu respostas CTL potentes contra células tumorais e modelos de desafio virais em ratinhos ^9. Aqui, usando ICMVs como um sistema de nanopartículas vacina modelo, descrevem métodos para caracterização de nano-vacinais formulações, incluindo tamanho de partícula e medições de potencial zeta e monitoramento do tráfico de partículas para linfonodos drenantes (dLNs) utilizando confocal imagem de tecidos criosseccionada ^7. Além disso, apresenta-se um método baseado no de imagem inteira em animais de análise de expansão de respostas por CTL em ratinhos após a transferência adoptiva de células específicas para o antigénio T CD8 + que expressam luciferase ^9,10. Finalmente, deescriba tetrâmero coloração de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) para quantificação longitudinal de respostas de células T endógenas em ratinhos vacinados com nanopartículas ^6,9.

ICMVs são uma formulação de nanopartículas à base de lípidos sintetizados por fusão controlada de lipossomas simples em estruturas multilamelares, que são então estabilizadas quimicamente por grupos de cabeça de fosfolípidos de reticulação funcionalizado com maleimida dentro camadas lipídicas com ditiol reticuladores ^6. Uma vez ICMVs são sintetizados, uma pequena fracção de nanopartículas podem ser usadas para determinar o tamanho de partícula e potencial zeta (isto é, carga de superfície das partículas), com um sistema de dispersão de luz dinâmica (DLS), e um analisador de potencial zeta. DLS medidas de mudanças na dispersão de luz em suspensões de partículas, permitindo a determinação do coeficiente de difusão e o tamanho hidrodinâmico de partículas ^11. Atingir o tamanho de partícula consistente de lote para lote é crítica sínteseuma vez que o tamanho de partícula é um dos principais factores que influenciam a drenagem linfática das partículas de vacinas para dLNs e subsequente absorção celular por APCs ^12,13. Além disso, o potencial zeta pode ser obtido por medição da velocidade das partículas, quando uma corrente eléctrica é aplicada, o que permite a determinação da mobilidade electroforética das partículas e superfície das partículas de carga ^11. Assegurar valores de potencial zeta consistentes de partículas é importante uma vez que a carga superficial das partículas determina a estabilidade coloidal, o que tem um impacto directo sobre a dispersão das partículas durante o armazenamento e após a administração in vivo ^14,15. A fim de controlar a localização das partículas para dLNs, ICMVs pode ser marcado com fluoróforos desejados, incluindo corantes lipofílicos e antigénios covalentemente marcados. A seguir à imunização, os ratos podem ser sacrificados em vários pontos temporais, dLNs ressecado, criosseccionada, e analisados ​​com microscopia confocal. Esta técnica permite a visualização de drai linfáticoNing de ambos os veículos de vacina para antigénio de nanopartículas e dLNs. As secções de tecido podem ser adicionalmente coradas com anticorpos marcado por fluorescência e utilizada para obter mais informação, tais como tipos de células associadas com o antigénio e a formação de centros germinais como mostrámos anteriormente ^7.

Uma vez que a síntese de partículas é optimizada e tráfico para os dLNs é confirmada, é importante para validar elicitação de expansão de CTL in vivo. A fim de analisar a elicitação de células específicas para o antigénio T CD8 + em resposta à vacinação de nanopartículas, nós utilizamos um modelo de antigénio, ovalbumina (OVA), _257-264 péptido com OVA (SIINFEKL) epítopo imunodominante de células T CD8 +, o que permite que as análises imunológicas detalhados de respostas de células T específicas para o antigénio para o desenvolvimento de vacinas inicial ^16,17. Em particular, para interrogar a dinâmica de expansão e migração de células específicas para o antigénio T CD8 +, que geraram ummodelo de ratinho transgénico duplo da luciferase do pirilampo por cruzamento de ratinhos transgénicos que expressam (Luc) com OT-I ratinhos transgénicos que possuem células T CD8 + com o receptor de células T (TCR) específico para SIINFEKL (em associação com H-2K ^b). A partir destes ratinhos OT-I / Luc, que expressam luciferase, as células AT-I T CD8 + pode ser isolado e preparado para transferência adoptiva para naive C57BL / 6. Uma vez semeadas, a imunização bem sucedida com nanopartículas contendo OVA resultará na expansão das células T transferidas, que podem ser controladas através da monitorização do sinal de bioluminescência com um sistema de imagem de animais ^9,10 todo. Esta técnica de imagem não invasiva de corpo inteiro foi usado com outros antigénios virais ou tumorais no passado ^18-20, processos envolvidos na expansão das células T em tecidos linfóides e difusão para os tecidos periféricos de um modo longitudinal revelando.

Complementar para análise de adoptivamente células específicas de antigénio transferidos T CD8 +, endógenoas respostas das células T após vacinação nos pode ser examinado com o complexo de péptido-histocompatibilidade principal (MHC) de ensaio de tetrâmero ^21, em que um complexo péptido-MHC de tetrâmero, que consiste de quatro marcado com fluoróforo do MHC de classe I de moléculas carregadas com epítopos de péptidos, é empregue TCR se ligar e marcar as células T CD8 + de um modo específico do antigénio. O ensaio de tetrâmero de péptido-MHC pode ser realizada tanto em estudos de necropsia terminais para identificar as células T CD8 + específicas para o antigénio em linfóides e tecidos periféricos ou em estudos longitudinais com células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtidas a partir de sangue em série chama. Após a coloração de linfócitos com péptido-MHC de tetrâmero, análise de citometria de fluxo é realizada por análises detalhadas sobre o fenótipo dos CTL ou quantificação da sua frequência entre as células T CD8 +.