Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц

Традиционные развития вакцины в основном использовали эмпирический подход опытной и ошибок. Тем не менее, с недавним развитием широкого спектра биоматериалов и открытий молекулярных детерминант иммунной активации, теперь можно рационально спроектировать вакцинных препаратов с биофизических и биохимических сигналов, полученных от патогенов ^1,2. В частности, различные частицы платформы доставки лекарств были рассмотрены в качестве носителей вакцинных как они могут быть совместно с грузом субъединиц антигенов и иммуностимулирующих агентов, защищать компоненты вакцины от деградации и повышения их сотрудничество доставку антиген-представляющие клетки (АРС), проживающих в лимфе узлы (LNS), таким образом, максимально иммунную стимуляцию и активацию ^3-5. В этом докладе мы описываем синтез "патогенных имитируя" системы наночастиц, называемые interbilayer сшитого многослойные везикулы (ICMVs), которые ранее были продемонстрированы как мощное platfor вакциным для надежных процессе индукции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и гуморального иммунного ответа в обоих системных и слизистых тканей отсеков ^6-9. В частности, вакцинация ICMVs достигается существенно повысить уровень IgG в сыворотке против малярийного антигена, по сравнению с вакцинацией с обычными вспомогательными веществами (например, квасцы и Montanide) ^7, а также вызвало мощные ответов CTL против опухолевых клеток и вирусных моделей призов у мышей ^9. Здесь, используя ICMVs как система наночастиц модель вакцины, мы опишем методы для характеризации нано-вакцин составов, в том числе размера частиц и дзета-потенциал измерений и отслеживания оборота частицы в дренирующих лимфоузлов (dLNs) с использованием конфокальной микроскопии в тканях cryosectioned ^7. Кроме того, мы представляем весь животного изображений на основе метода анализа расширение ответов CTL у мышей после усыновителя передачи люциферазы выражения антиген-специфических CD8 + Т-клеток ^9,10. Наконец, мы деписец тетрамер окрашивания мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) для продольной количественного эндогенных ответов Т-клеток у мышей, вакцинированных с наночастицами ^6,9.

ICMVs являются липидов на основе наночастиц препарат синтезированы путем регулируемого синтеза простых липосом в многослойных структурах, которые затем химически стабилизированных сшивающих головных групп фосфолипидов малеимид-функционализированного в липидных слоев с дитиольному сшивающих агентов ^6. После ICMVs синтезируются, небольшая часть наночастиц может быть использовано для определения размера частиц и дзета-потенциал (т.е. поверхностный заряд частиц) с (DLS) системы динамического светорассеяния и дзета-потенциал анализатора. DLS измеряет изменения в рассеянии света в суспензии частиц, что позволяет определение коэффициента диффузии и гидродинамического размера частиц ^11. Достижение последовательной размер частиц от партии к партии синтеза является критическимс размером частиц является одним из основных факторов, влияющих на лимфатический дренаж частиц вакцины в dLNs и последующего клеточного поглощения БТР ^12,13. Кроме того, дзета-потенциал может быть получен путем измерения скорости частиц, когда электрический ток подводится, которая позволяет определять электрофоретической подвижности частиц и поверхности частиц заряда ^11. Обеспечение последовательного дзета-потенциал значения частиц является важным, поскольку поверхностный заряд частиц определяет стабильность коллоидного, который имеет непосредственное влияние на дисперсию частиц во время хранения и после введения в естественных условиях ^14,15. Для того, чтобы отслеживать локализацию частиц в dLNs, ICMVs могут быть помечены с заданными флуорофорами в том числе липофильных красителей и ковалентно-меченых антигенов. После иммунизации мышей может быть умерщвлены в различные моменты времени, dLNs резекции, cryosectioned и анализировали с конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет визуализировать лимфатической DraIНин обоих перевозчиков и антигена dLNs вакцин наночастиц. Разделы ткани могут быть дополнительно окрашены флуоресцентной меченых антител и используется для получения более подробной информации, такие как типы клеток, связанных с антигеном и формирования зародышевых центров, как мы показали, ранее ^7.

После синтеза частиц оптимизирован и торговля в dLNs подтвердится, это очень важно для проверки выявление в в естественных условиях расширения CTL. Для того чтобы проанализировать извлечение антиген-специфических CD8 + Т-клеток в ответ на вакцинацию наночастиц, мы использовали модели антиген, овальбумин (OVA), с OVA _257-264 пептида (SIINFEKL) иммунодоминантном CD8 + Т-клеточного эпитопа, который позволяет детально иммунологические анализы антиген-специфических ответов Т-клеток для первоначального ^16,17 разработки вакцины. В частности, допрашивать динамику расширения и миграции антиген-специфических CD8 + Т-клеток, мы сформировалидважды трансгенной мышиной модели, пересекая люциферазы светляков-выражения трансгенных мышей (Luc) с OT-I у трансгенных мышей, которые обладают CD8 + Т-клеток с Т-клеточного рецептора (TCR), специфичные для SIINFEKL (в связи с Н-2К ^б). Из этих мышей ОТ-I / Luc, экспрессирующих люциферазы, ОТ-я CD8 + Т-клетки могут быть выделены и подготовлены для передачи в приемной наивных мышей C57BL / 6. После семенами, успешное иммунизация OVA-наночастиц приведет к расширению переданных Т-клеток, которые можно отслеживать с помощью мониторинга сигнал биолюминесценции с всей системы формирования изображений животных ^9,10. Это неинвазивный метод визуализации всего тела был использован с другими вирусными или опухолевых антигенов в прошлом ^18-20, выявление процессов, участвующих в разложении Т клеток в лимфоидных тканей и распространения в периферических тканях в продольном образом.

В дополнение к анализу адаптивно переданных антиген-специфических CD8 + Т-клеток, endogenoСША T-клеточные ответы после вакцинации могут быть рассмотрены с пептидом главного комплекса гистосовместимости (МНС) тетрамер анализа ^21, в котором тетрамер комплекс пептид-МНС, состоящая из четырех флуорофора с метками МНС-молекул класса I, загруженной с пептидных эпитопов, используют чтобы связать TCR и этикеток CD8 + Т клеток в антиген-специфическим образом. Пептид-МНС тетрамер анализ может выполняться либо в терминальных вскрытии исследований для выявления антиген-специфических CD8 + Т-клеток в лимфоидных и периферических тканях или в продольных исследованиях с мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), полученных от последовательный забор крови. После окрашивания лимфоцитов с пептид-МНС тетрамер, проточной цитометрии анализа выполняется для детального анализа на фенотип ЦТЛ или количественной оценки их частоты среди CD8 + Т-клеток.