Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Traditionele ontwikkeling vaccin is vooral in dienst van de empirische benadering van trial-and-error. Echter, met de recente ontwikkeling van een breed scala van biomaterialen en de ontdekking van moleculaire determinanten van immuunactivatie is het nu mogelijk om rationeel ontwerpen vaccinformuleringen met biofysische en biochemische signalen afkomstig van pathogenen ^1,2. In het bijzonder hebben verschillende deeltjes drug delivery platforms onderzocht als vaccin dragers als ze kunnen samen worden geladen met subunit antigenen en immuunstimulerende middelen, vaccin componenten te beschermen tegen afbraak, en het vergroten van hun co-levering aan antigen presenterende cellen (APC's) die in lymfe nodes (LNS), waardoor het maximaliseren immuunstimulatie en activering ^3-5. In dit rapport beschrijven we de synthese van een "pathogeen-nabootsen" nanodeeltjes systeem, genaamd interbilayer-verknoopt multilamellaire blaasjes (ICMVs), die al eerder hebben aangetoond als een krachtige vaccin platform voor uitlokken van krachtige cytotoxische T lymfocyt (CTL) en humorale immuunresponsen bij zowel systemische als mucosale weefselcompartimenten ^6-9. In het bijzonder, de gerealiseerde vaccinatie met ICMVs aanzienlijk serum IgG niveaus versterkt tegen een malaria-antigeen, in vergelijking met vaccinatie met conventionele adjuvantia (bijvoorbeeld, aluin en Montanide) ⁷ en ook opgewekt potente CTL-responsen tegen tumorcellen en virale uitdaging modellen in muizen ^9. Hier, met behulp van ICMVs als model vaccin nanodeeltje systeem beschrijven we methoden voor de karakterisering van het vaccin nano-formuleringen, met inbegrip van de deeltjesgrootte en zetapotentiaal metingen en het bijhouden van de deeltjes mensenhandel aftappen LNS (DLNS) gebruik te maken van confocale beeldvorming van cryosectioned weefsels ^7. Bovendien presenteren we een hele dier imaging-gebaseerde werkwijze voor het analyseren expansie van CTL-responsen bij muizen na adoptieve overdracht van luciferase-expressie antigeenspecifieke CD8 + T-cellen ^9,10. Ten slotte hebben we deschrijver tetrameer kleuring van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) voor longitudinaal kwantificatie van endogene T cel responsen in muizen gevaccineerd met nanodeeltjes ^6,9.

ICMVs zijn een lipide-gebaseerde nanopartikelformulering gesynthetiseerd door gecontroleerde fusie van eenvoudige liposomen in multilamellaire structuren, die vervolgens chemisch worden gestabiliseerd door verknoping-maleïmide gefunctionaliseerde fosfolipide kopgroepen binnen lipide lagen met dithiol crosslinkers ^6. Zodra ICMVs worden gesynthetiseerd, kan een klein deel van nanodeeltjes worden gebruikt om deeltjesgrootte en zeta potentiaal (bijv oppervlaktelading van de deeltjes) met dynamische lichtverstrooiing (DLS) systeem en een zeta potentiaal analyzer bepaald. DLS maatregelen veranderingen in de lichtverstrooiing in deeltjessuspensies, waardoor de bepaling van de diffusiecoëfficiënt en de hydrodynamische grootte van de deeltjes ^11. Het bereiken van consistente deeltjesgrootte van partij tot partij synthese is van cruciaal belangaangezien deeltjesgrootte een van de belangrijkste factoren die van invloed lymfatische drainage vaccin deeltjes DLN en daaropvolgende cellulaire opname door APCs ^12,13. Bovendien kan zeta potentiaal worden verkregen door meting van de deeltjessnelheid bij een elektrische stroom wordt aangelegd, met behulp waarvan de elektroforetische mobiliteit van deeltjes en deeltjes oppervlaktelading ¹¹ toelaat. Consistente zeta potentieel waarden van de deeltjes is belangrijk omdat oppervlakte lading van de deeltjes bepaalt colloïdale stabiliteit, die een directe impact op deeltjesdispersie tijdens opslag en na de in vivo toediening ^14,15 heeft. Om het deeltje lokalisatie DLN's volgen, kan ICMVs met de gewenste fluoroforen zoals lipofiele kleurstoffen en covalent gelabeld antigenen worden geëtiketteerd. Na immunisatie kunnen muizen worden gedood op verschillende tijdstippen DLN gereseceerd, cryosectioned en geanalyseerd met confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van lymfatische draining van zowel de nanodeeltjes vaccin vervoerders en antigeen DLN. De weefselcoupes kunnen bovendien worden gekleurd met fluorescent gemerkte antilichamen en gebruikt om meer informatie te verkrijgen, zoals soorten cellen verbonden met het antigeen en de vorming van germinale centra zoals we eerder hebben ⁷ getoond.

Zodra het deeltje synthese wordt geoptimaliseerd en handel met de DLN wordt bevestigd, is het belangrijk uitlokken van in vivo CTL expansie valideren. Om uitlokken van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen te analyseren in respons op nanodeeltjes vaccinatie hebben we een model antigeen, ovalbumine (OVA) gebruikt, met OVA peptide _257-264 (SIINFEKL) immunodominante CD8 + T-celepitoop, dat gedetailleerde immunologische analyses toelaat antigeen-specifieke T cel responsen voor de eerste vaccinontwikkeling ^16,17. In het bijzonder om de dynamiek van expansie en migratie van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen ondervragen, hebben we gegenereerd eendubbel transgeen muismodel door kruising firefly luciferase-expressie transgene muizen (Luc) met OT-I transgene muizen die CD8 + T-cellen met T-celreceptor (TCR) specifiek voor SIINFEKL (in samenwerking met ^H-2Kb) bezitten. Uit deze OT-I / Luc muizen-luciferase expressie, OT-I CD8 + T-cellen kunnen worden geïsoleerd en voorbereid voor adoptieve overdracht naïeve C57BL / 6-muizen. Eenmaal gezaaide zal succesvolle immunisatie met OVA bevattende nanodeeltjes resulteren in uitzetting van de overgedragen T-cellen, die kunnen worden gevolgd door het volgen van de bioluminescentie signaal met een geheel dier beeldvormingssysteem ^9,10. Deze niet-invasieve whole-body imaging techniek is gebruikt met andere virale en tumor antigenen in het verleden ^18-20, openbaren processen van T-cel expansie in lymfoïde weefsels en verspreiding perifere weefsels in een longitudinale wijze.

Aanvullende analyses van adoptief overgedragen antigeenspecifieke CD8 + T-cellen, endogenoons T cel responsen na vaccinatie kunnen worden onderzocht met peptide-major histocompatibility complex (MHC) tetrameer assay ^21, waarbij een peptide-MHC tetrameer complex, bestaande uit vier-fluorofoor gelabeld MHC-klasse I moleculen geladen met peptide-epitopen wordt toegepast TCR label en CD8 + T-cellen binden in een antigeen-specifieke wijze. Het peptide-MHC tetrameer assay kan worden uitgevoerd in terminal necropsie onderzoeken antigeen-specifieke CD8 + T-cellen in lymfoïde en perifere weefsels te identificeren of longitudinale studies met perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) verkregen uit seriële bloedafnames. Na kleuren lymfocyten met peptide-MHC tetrameer, flowcytometrie analyse uitgevoerd voor gedetailleerde analyses op het fenotype van CTLs of kwantificatie van de frequentie tussen CD8 + T-cellen.