Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditionelle Impfstoffentwicklung hat überwiegend beschäftigt die empirischen Ansatz von Versuch und Irrtum. Jedoch mit der jüngsten Entwicklung einer breiten Palette von Biomaterialien und Entdeckung von molekularen Determinanten Aktivierung des Immunsystems ist es nun möglich, rationell Vakzinformulierungen mit biophysikalische und biochemische Hinweise von Pathogenen ^1,2 abgeleitet. Insbesondere wurden verschiedene partikulären Drug-Delivery-Plattformen als Impfstoffträger, da sie mit Untereinheiten-Antigenen und immunstimulierende Mittel gemeinsam geladen werden untersucht, Impfstoffkomponenten Schutz vor Abbau, verbessern und ihre Co-Lieferung an präsentierenden Zellen Antigen (APCs) mit Wohnsitz in der Lymphe Knoten (LNS), damit die Maximierung Immunstimulation und Aktivierung ^3-5. In diesem Bericht beschreiben wir die Synthese eines "pathogen-imitiert" Nanopartikel-System, genannt interbilayer netzten multilamellare Vesikel (ICMVs), die zuvor als ein potenter Impfstoff platfor demonstriert wordenm für die Auslösung robust zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und humorale Immunreaktionen sowohl systemische und Schleimhautgewebe Fächer ^6-9. Insbesondere erzielte Impfung mit ICMVs wesentlichen Serum-IgG-Ebenen verstärkt gegen eine Malaria-Antigen, gegenüber der Impfung mit üblichen Hilfsmitteln (zB Alaun und Montanide) ⁷ und auch ausgelöste starke CTL-Antworten gegen Tumorzellen und virale Herausforderung Modellen in Mäusen ^9. Hier mit ICMVs als Modell-Impfstoff Nanopartikelsystem beschreiben wir Methoden zur Charakterisierung von Nano-Impfstoff-Formulierungen, einschließlich Partikelgröße und Zetapotentialmessungen und Verfolgung von Menschenhandel zu Partikel Ablassen LNs (DLNs) nutzen konfokale Bildgebung von Gewebe gefriergeschnitten ^7. Zusätzlich stellen wir eine Ganztier-Bildgebung basierte Verfahren zum Analysieren Expansion von CTL-Antworten in Mäusen nach dem adoptiven Transfer von Luciferase-exprimierende Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen ^9,10. Schließlich definieren wirRitz Tetramerfärbung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu Längs Quantifizierung der endogenen T-Zell-Antworten in Mäusen, die mit Nanopartikeln ^6,9 geimpft.

ICMVs eine lipidbasierte Nanopartikel-Formulierung durch kontrollierte Fusion von Liposomen einfach synthetisiert in multilamellaren Strukturen, die dann chemisch durch Vernetzung Maleimid-funktionalisierten Phospholipid-Kopfgruppen in Lipidschichten mit Dithiol Vernetzer ⁶ stabilisiert werden. Sobald ICMVs synthetisiert werden, kann ein kleiner Anteil von Nanopartikeln verwendet werden, um Teilchengröße und Zeta-Potential (das heißt, die Oberflächenladung der Teilchen) mit einer dynamischen Lichtstreuung (DLS) System und ein Zeta-Potential-Analysegerät ermitteln. DLS misst Änderungen der Lichtstreuung in Partikelsuspensionen, was die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten und die hydrodynamische Größe von Partikeln ^11. Konsistente Teilchengröße von Charge zu Charge Synthese kritischDa Teilchengröße gehört zu den wichtigsten Faktoren, die Lymphdrainage Impfstoffpartikel DLNs und anschließende zelluläre Aufnahme durch APCs ^12,13. Zusätzlich kann Zetapotential durch Messen der Partikelgeschwindigkeit, wenn ein elektrischer Strom angelegt wird, die Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Partikeln und Partikeloberflächenladung ¹¹ können erhalten werden. Konsistente Werte Zeta-Potential von Teilchen ist wichtig, da Oberflächenladung der Teilchen bestimmt, kolloidale Stabilität, die direkten Einfluss auf die Dispersion während der Lagerung und nach der Verabreichung in vivo ^14,15 hat. Um die Partikellokalisierungs zu DLNs verfolgen, können ICMVs mit gewünschten Fluorophore einschließlich lipophilen Farbstoffen und kovalent-markierten Antigene bezeichnet werden. Nach der Immunisierung können Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten getötet werden, DLNs reseziert gefriergeschnitten und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von lymphatischen draining sowohl der Nanopartikel Impfstoffträger und Antigen DLNs. Die Gewebeschnitte können zusätzlich mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und verwendet, um weitere Informationen zu erhalten, wie die Typen von Zellen mit dem Antigen, und die Bildung von Keimzentren assoziiert gefärbt, wie wir vorher ⁷ gezeigt werden.

Sobald die Partikelsynthese optimiert und Handels den DLNs bestätigt wird, ist es wichtig, Auslösung in vivo CTL-Expansion zu validieren. Um Hervorrufen von antigenspezifischen CD8 + -T-Zellen als Reaktion auf die Impfung Nanopartikel zu analysieren, haben wir eine Modellantigen, Ovalbumin (OVA) verwendet, die mit OVA _{257-264-Peptid} (SIINFEKL) immun CD8 + T-Zell-Epitop, das detaillierte immunologischen Analysen ermöglicht von Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten für die anfängliche Entwicklung von Impfstoffen ^16,17. Insbesondere, um die Dynamik der Expansion und Migration von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen zu befragen, erzeugten wir haben eindoppelt transgenen Mausmodell durch Kreuzung Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden transgenen Mäusen (Luc) mit OT-I-transgenen Mäusen, die CD8 + T-Zellen mit T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch für SIINFEKL (in Verbindung mit H-2K ^b) besitzen. Aus diesen OT-I / Luc Mäusen, Luciferase-exprimierenden kann OT-I CD8 + -T-Zellen isoliert und zur adoptiven Transfer in naiven C57BL / 6-Mäusen hergestellt werden. Sobald ausgesät werden erfolgreiche Immunisierung mit OVA haltigen Nanopartikeln in Expansion der übertragenen T-Zellen, die durch die Überwachung des Biolumineszenz-Signals mit einem ganzen Tier Abbildungssystems ^9,10 verfolgt werden können führen. Diese nicht-invasive Ganzkörper-Bildgebung Technik hat mit anderen viralen oder Tumorantigene, die in der Vergangenheit ^18-20 angewandt, sodass Prozesse in T-Zell-Expansion in Lymphgewebe und Verbreitung in die peripheren Gewebe in Längs Weise beteiligt.

Komplementär zur Analyse adoptiv transferierte Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen, endogenous T-Zell-Reaktionen nach der Impfung mit dem Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Tetramer-Assay ^21, bei dem ein Peptid-MHC-Tetramer-Komplex, bestehend aus vier Fluorophor-markierten MHC-Klasse I-Moleküle mit Peptid beladen Epitope untersucht werden, wird verwendet, TCR und Etiketten CD8 + T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Art und Weise zu binden. Der Peptid-MHC-Tetramer-Assay kann entweder im Terminal Nekropsie Studien zur Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen in lymphoiden und peripheren Gewebe zu identifizieren oder in Langzeitstudien mit peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von der seriellen Blutabnahmen durchgeführt werden, erhalten. Nach Färbung Lymphozyten mit Peptid-MHC-Tetramer, Durchflusszytometrie Analyse wird für detailliertere Analysen auf den Phänotyp von CTLs oder Quantifizierung ihrer Häufigkeit bei CD8 + T-Zellen durchgeführt.