Опробование клеток крови народам<em> Дрозофилы</em> Личинка
Summary
Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
Abstract
У позвоночных, кроветворения регулируется индуктивных микросреды (ниши). Точно так же, в беспозвоночных модель организма дрозофилы, индуктивные микросреды, известные как личинки кроветворных Карманы (НР) были определены в качестве анатомических участков для развития и регулирования крови (гемоцитов), в частности, самообновлению макрофагов. НР являются сегментно повторяется карманы между эпидермисом и мышечных слоев личинки, что также включают сенсорные нейроны периферической нервной системы. В личинки, резиденты (неподвижных) гемоцитов воздействию антиапоптозную, клея и пролиферативных сигналы от этих сенсорных нейронов и потенциально других компонентов НР, таких как мышцы и футеровки эпителиальных слоев. Во время нормального развития, постепенного высвобождения гемоцитах резидентов от ГЭС топлива население оборотных гемоцитах, который завершается в освобождении месул-резидентов гемоцитах в начале метаморфоза. Иммунные нападения, физические травмы или механическое нарушение вызвать преждевременное высвобождение гемоцитах резидентов в обращении. Выключатель личинок гемоцитах между резидентами и местах обращения возникает необходимость общей стандартной процедуры / избирательно изолировать и количественно эти две популяции клеток крови из одного личинок дрозофилы. Соответственно, этот протокол описывает метод автоматического освободить и количественно житель и циркулирующих гемоцитов из одной личинки. Метод способствует исключая виво подходы, и может быть адаптирован к служить различные стадии развития дрозофилы и других беспозвоночных организмов.
Introduction
Исследования в беспозвоночных модели дрозофилы привела открытие врожденного иммунитета 1, и способствовало понимание различных аспектов развития клеток крови 2-4. Дрозофилы кроветворение можно разделить на линии эмбриональных / личиночной гемоцитах, которые происходят в эмбрион и расширяться в личинки, и родословная лимфатических желез гемоциты 4,5. Здесь мы приводим протокол, который сосредотачивается на линии эмбриональных / личиночной гемоцитах, которые в личинки дрозофилы в основном содержит плазматоцитов (макрофаги) и несколько кристаллов 4 клетки. В личинки, гемоциты эмбриона сохраняются и колонизировать сегментарно повторные и терминальные кроветворных Карманы (HPS), расположенных между эпидермисом и мышечными слоями личиночной стенки тела 5,6. На основании своей природе, как самообновляющихся макрофагов 6, их преимущественного проживания в местных микросреды ткани 6, 7, и их происхождение с самых ранних клеток крови, возникающих при разработке 6,8, это население клеток крови считается похож на позвоночных самообновляющихся тканевых макрофагов, независимого миелоидной недавно идентифицированного в различных видов 4,9,10. Тем не менее, у дрозофилы, некоторые или все из этих резидентных клеток также показывают, пластичность, чтобы привести к другим типам клеток крови, таких как кристаллических ячеек 11,12.
Личинки гемоциты преимущественно житель (сидячие), но находятся в динамическом стационарном между различными НР. Они постепенно выпустили в обращение, в частности, в 3-й возрастной стадии личинки подходы pupariation 5-7. Иммунные проблемы, травмы или механическое нарушение приводит к преждевременной, в последнем случае обратимых, мобилизация резидентов гемоцитах в гемолимфе 4,6,13.
Предыдущие исследования показали, что житель и оборотныхличинок гемоциты имеют то же происхождение, но отличаются в своих липких или самонаведения свойств 6,7,13,14. Селективная изоляция оборотных против резидентов гемоцитах показал повышенные уровни распространения в популяции резидента гемоцитов, предполагая, их воздействие на индуктивных сигналов от личиночной НР НР 6. Drosophila выложены эпидермиса и мышечных слоев и далее укрывают сенсорного нейрона кластеры периферической нервной системы (ПНС) и функции печени, напоминающие oenocytes 6. Функционально, мутантные и генетические эксперименты клеток абляции показали, что сенсорные нейроны, присутствующие в НР поддерживать трофическую выживание и локализации личинок гемоцитах 6.
Здесь мы опишем метод для конкретного изоляции и количественного резидента и оборотных гемоцитах из одной личинки дрозофилы, и протокол для механической мобилизации гемоцитов. Эти методы могут быть использованы для экс вивоИзучение гемоцитов и может быть выполнено с возможностью других стадиях развития Drosophila, таких как куколки и взрослые, и других беспозвоночных систем. Так предыдущие исследования не отличить жителя и оборотных гемоцитах, этот протокол обеспечивает общий стандарт для изучения резидентов клеток крови и поможет повысить согласованность беспозвоночных исследования клеток крови.
Во-первых, гемоцитов Кровотечение / Скрип Анализ описывает дифференциальный изоляции и автоматизированной количественной флуоресцентной жителя белка отмечается и оборотных форменные элементы крови от одного населения личинок дрозофилы; Протокол предусматривает два варианта для постоянных и плитки сканирования оборудованных микроскопами (рисунок 1). В результате процент циркулирующих гемоцитов и общее количество гемоцитов в личинки получены. Метод основан на трансгенных личинок дрозофилы, которые выражают флуоресцентного белка среди их клетки кровиНаселение. Выбор водителя гемоцитов или репортера определяет исход, т.е., что популяция клеток крови визуализируется и количественно. Для маркировки, главным образом, макрофаги (плазматоцитов), которые составляют подавляющее большинство резидента и циркулирующей гемоцитов населения личинки дрозофилы 6, подходящие трансгены включают Hml Д-6, DsRed HmlΔ -GAL4 15 Рхп -GAL4 16 CRQ-GAL4 (по Х. Agaisse 16), или пожиратель-GAL4 17; для маркировки относительно небольшое население кристаллических ячеек, подходящих линий BcF6-КФП и -GFP 18, или LZ-GAL4 (Дж Поллока 19); для маркировки lamellocytes, специализированный тип клеток, главным образом, индуцируется иммунной проблем и травм 13, например, MSNF9mo-mCherry могут быть использованы 17. Некоторые водители трансгенные выражены в диапазоне дифференцированного кровиклетки и клетки-предшественники, такие как он – GAL4 20, маркирует около 80% всех личинок кровяных клеток. 20 Пожалуйста, обратите внимание, что во всех случаях, когда используются драйверы Gal4, сочетание с UAS-GFP или другого флуоресцентного белка UAS-трансгена требуется. В разделе Результаты, этот метод используется для мониторинга количества клеток крови и поведение циркуляции в течение личиночного развития.
Во-вторых, гемоцитов Нарушение Анализ описывает предыдущий шаг, предназначенный для отсоединения резидентов гемоциты внешней манипуляции, которые впоследствии позволяет оценить способности гемоцитов повторного соблюдайте и домой НР в течение ограниченного периода времени (30 – 60 мин) 6. Обычно этот анализ сопровождается Bleed / Scrape анализа для определения процентного содержания циркулирующих гемоцитов в личинки. Мы представляем упрощенную протокол для этого анализа (рис 1D), которая использует нарушение встряхиванием остроумияч стеклянные бусы, а не манипулирование одной личинки с кистью, как описано ранее 6. В разделе Результаты этого анализа используется для демонстрации того, что временно удаленные гемоциты поплавок в гемолимфе и могут быть восстановлены во фракции циркулирующих гемоцитов. Анализ также полезно для количественной оценки различий в их гемоцитах самонаведения / адгезией к резидентам сайтов, сравнивая, например, различные генетические, фоны или условия стимуляции. Пожалуйста, обратите внимание, что эта механическая манипуляция отражает обратимый процесс и отличается от infection- или травмы, вызванной мобилизации житель гемоцитов, которые обычно не обратимы в короткий промежуток времени 4,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем первый метод для количественного восстановления резидентов и циркулирующие в крови клетки от одного личинок дрозофилы, и количественно эти две популяции гемоцитов. Протокол включает в себя последовательный выпуск оборотных и резидентов клеток крови, а затем и автоматизированной обработки изображений подсчета клеток. Личинки гемоциты резиденты могут быть временно мобилизованы в обращение путем механического нарушения, процесс, который, как известно, в значительной степени восстанавливается в течение 30 – мин восстановительного периода 60 6. Соответственно, этот протокол был испытан в двух направлениях, (1) путем оценки общего числа гемоцитов за личинки и фракции циркулирующих гемоцитов в течение личиночного развития, и (2) экспериментально выбивании гемоцитов резидентные с использованием автоматизированного метода, который подтвердил тесная корреляция из гемоцитов локализации и гемоцитов числа в жителя и оборотных населения. Кроме того, воспроизводимость метода была продемонстрирована путем совместнойmparing два набора данных биологических повторностях.
В прошлом, лаборатории использовали ряд методов для количественной оценки личинок гемоциты 6,13,21. Этот протокол устанавливает общий стандарт для получения и количественно-резидентов и циркулирующих клеточных популяций крови от личинок дрозофилы, обеспечивая легко адаптируемые платформу. Метод, описанный имеет решающее значение для исследований, которые сосредоточены на роли гемоцитах резидентов и их микросреды, кроветворной Карманы 4-6, и подходит для изучения флуоресцентный белок трансгенных несущих штаммов дрозофилы в дикого типа и генетически модифицированных фоны. Протокол также имеет отношение к исследованиям, которые сосредоточены на мобилизации гемоцитов после иммунной вызов или травмы, и генетически или экологически индуцированной сигнализации, который вызывает мобилизацию резидентов гемоцитах или изменения в общем количестве гемоцитов (обзор 4). Следует отметить, что в случаях преждевременной диfferentiation и выпуск гемоцитов из лимфатических желез, выделения эмбриональных / личинок по сравнению с лимфатических узлов линий может быть ограничена паттерна экспрессии флуоресцентного гемоцитов репортера используется.
Протокол, представленные здесь опирается на живого изображения, флуоресцентно-меченных гемоцитах. В будущем, она может быть изменена, чтобы позволить обнаружение высвобожденные клетки после фиксации, например, с помощью иммуноцитохимии. В этом случае протокол может должны быть адаптированы, чтобы обеспечить полное склеивание клеток крови, например, путем увеличения времени адгезии инкубации и добавлением клейкой слайд покрытие, например, конканавалин А. Поскольку метод позволяет извлекать гемоцитов и их манипуляции экс естественных, это принесет пользу широкий спектр биологических и биохимических исследований с развитием, клеток. Резиденты и циркулирующей крови клетки находятся во всех постэмбрионального стадиях развития дрозофилы и других беспозвоночных, 22 suggestiнг, что адаптация этого метода выиграют широкий спектр исследований за пределами системы личинок Drosophila кроветворной.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Йеспер Kronhamn и Дэна Hultmark, Майкл Galko, и Блумингтон Stock центр для запасов лету. Отдельное спасибо Кортни Онодера за советом с статистического анализа. Мы благодарим Катрина золото для критического чтения рукописи, и Калпана Макхиджани, Катрина Gold, сотрудников лаборатории Derynck и членов лаборатории Nystul для обсуждения и замечания по рукописи. Эта работа была поддержана грантами от программы UCSF для Прорыв биомедицинских исследований (PBBR), Широкий Центр, Hellman фонда, Американское общество рака RSG DDC-122595, американская ассоциация сердца 13BGIA13730001, Национальный научный фонд 1326268, Национальные институты здравоохранения и 1R01GM112083-01 1R56HL118726-01A1 (в КБ).
Materials
| 6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
| Water squirt bottle | |||
| Metal spoon/spatula | |||
| Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
| Glass cavity dish | |||
| PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
| Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
| Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
| Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
| Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
| Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
| Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
| Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
| 2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
| Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
| Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
| Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5, 673-690 (2003).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Gold, K. S., Brückner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).
- Makhijani, K., Brückner, K. Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva. Fly. 6, 254-260 (2012).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Brückner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138, 5379-5391 (2011).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230, 243-257 (2001).
- Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. The two origins of hemocytes in Drosophila. Development. 130, 4955-4962 (2003).
- Sieweke, M. H., Allen, J. E. Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages. Science. 342, 1242974 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature immunology. 14, 986-995 (2013).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biology Open. 1-9, (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. eLife. , (2015).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).
- Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes. Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Gajewski, K. M., et al. Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila. Genesis. 45, 200-207 (2007).
- Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science. 288, 146-149 (2000).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).
- Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila. Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
