Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em> Drosophila melanogaster</em> Larva
Summary
Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
Abstract
Omurgalılarda, hematopoez endüktif mikroçevrelerde (nişler) tarafından düzenlenir. Benzer şekilde, omurgasız bir model organizma Drosophila melanogaster, larva Hematopoietik cepler (HPS) olarak bilinen indüktif mikroçevrelerde kendini yenileyen makrofaj özellikle gelişimi ve kan hücreleri (hemocytes) düzenlenmesi için anatomik bölgelerden olarak tespit edilmiştir. HPS olan segmental da periferal sinir sisteminin duyusal nöronlar ihtiva larva epidermis ve kas tabakaları arasındaki cepler tekrarladı. Larva olarak, ikamet (sesil) hemocytes, anti-apoptotik, yapıştırıcı ve bu duyusal nöronlar gelen çoğalma kuyruklar ve astar kas ve epitel katman olarak HPS potansiyel olarak diğer bileşenleri maruz kalmaktadır. HPs yakıtlardan normal gelişim, yerleşik hemocytes kademeli olarak gevşetmek sırasında mo sürümünde doruğa dolaşan hemocytes nüfusu,metamorfoz başında ikamet hemocytes st. Bağışıklık saldırılar, fiziksel yaralanma ya da mekanik rahatsızlık dolaşıma ikamet hemocytes prematüre salınımını tetikler. Ikamet yerleri ve dolaşım arasındaki larva hemocytes anahtarı seçici ayırmak ve tek Drosophila larva kan hücrelerinin bu iki popülasyonlarının ölçmek için ortak bir standart / prosedür gereksinimini artırmaktadır. Buna göre, bu protokol bırakın ve tek larva yerleşik ve dolaşımdaki hemocytes ölçmek için otomatik bir yöntem açıklanır. Yöntem, ex vivo yaklaşımlar kolaylaştırır ve Drosophila aşamalar ve diğer omurgasız organizma, çeşitli hizmet etmek için adapte edilmiş olabilir.
Introduction
Omurgasız modelinde Drosophila melanogaster Araştırma doğal bağışıklık 1 keşif sürdü ve 2-4. Drosophila hematopoiezis menşei embriyonik / larva hemocytes soyu, ayrılabilir kan hücresi gelişiminin çeşitli yönlerini anlaşılmasını kolaylaştırdı Embriyo ve larva genişletmek ve lenf bezinin soy 4,5 Hemocytes. Burada, Drosophila larva çoğunlukla plazmatositler (makrofajlar) ve birkaç kristal hücreler 4 içermektedir larva / embriyonik hemocytes soyu, odaklanan bir protokol mevcut. Epidermis ve larva vücut duvarının 5,6 kas tabakaları arasında yer alan larva olarak, embriyo hemocytes devam ve kolonize segmental tekrarlanan ve terminal Hematopoetik cepler (HPS). Kendini yenileyen makrofajlar 6, lokal doku mikroçevrelerde 6 onların baskın ikametgah olarak doğaları dayanarakGelişme 6,8 edilirken ortaya çıkan erken kan hücreleri 7 ve bunların soyu, bu kan hücre popülasyonu omurgalı kendini yenileyen doku makrofajları, son türlerin 4,9,10 çeşitli tespit bağımsız myeloid benzer kabul edilir. Bununla birlikte, Drosophila, bir kısmı veya yerleşik hücrelerin tümü, aynı zamanda plastisite gibi kristal hücreleri 11,12 gibi diğer kan hücre tiplerinin sebep göstermek.
Larva hemocytes ağırlıklı ikamet (sapsız) vardır, ancak çeşitli HPs arasında dinamik kararlı durumdadır. 3. instar larva pupariation 5-7 yaklaşırken Onlar kademeli özellikle dolaşıma salınır. Hemolimf 4,6,13 içine Bağışıklık geri dönüşümlü ikinci durumda zorluklar, erken yaralanma veya mekanik bozukluk kurşun, yerleşik hemocytes seferberlik.
Önceki çalışmalar ikamet önerdi ve dolaşımdakiLarva hemocytes aynı soydan gelen, ancak bunların yapışkan veya hedef arama özellikleri 6,7,13,14 farklıdır. Yerleşik hemocytes karşı dolaşan seçici izolasyonu Periferik Sinir Sistemi duyusal nöron kümeleri epidermis ve kas tabakaları ile kaplı ve ayrıca liman olan HP'nin 6. Drosophila larva HPS gelen endüktif ipuçlarına maruz kaldıkları öne ikamet hemocyte nüfusun çoğalması düzeyi yüksek saptandı (PNS) ve karaciğer fonksiyon oenocytes 6 benzeyen. İşlevsel, mutant ve genetik hücre ablasyon deneyler HPS'de bulunan duyusal nöronlar larva hemocytes 6 trofik hayatta kalma ve lokalizasyonu destekleyen olduğunu göstermiştir.
Burada belirli bir izolasyon ve ikamet ölçümü ve tek Drosophila larva dolaşan hemocytes ve mekanik hemocyte seferberlik için bir protokol için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, ex vivo kullanılabilirhemocytes çalışması ve ayrıca, pupa ve erişkin ve diğer omurgasız sistemleri gibi diğer Drosophila gelişim aşamalarına uyarlanabilir. Önceki çalışmalar yerleşik ve dolaşımdaki hemocytes ayırt etmedi beri, bu protokol ikamet kan hücrelerinin çalışma için ortak bir standart sağlar ve omurgasız kan hücre araştırmalarının tutarlılığını artırmak için yardımcı olacak.
İlk olarak, Hemosit Taşma Payı / Pençe Deneyi diferansiyel izolasyonu ve floresan protein-işaretlenmiş ikamet ve tek Drosophila larva hemocyte popülasyonlarının dolaşan otomatik ölçümü açıklar; protokol, düzenli ve kiremit tarama donanımlı mikroskopları için iki seçenek (Şekil 1) sağlar. Bunun bir sonucu olarak, dolaşımdaki hemocytes yüzdesi ve larva için hemocytes sayısı elde edilir. Yöntem kan hücresinin içinde floresan protein ifade transgenik Drosophila larva dayanırNüfus. Hemocyte sürücüsü veya muhabir seçimi kan hücrelerinin nüfusu görüntülenmiştir ve sayısal olan, yani sonucunu belirler. Ağırlıklı olarak etiketlemek için makrofajlar ikamet ve Drosophila larva 6 dolaşımdaki hemocyte nüfusunun büyük çoğunluğunu oluşturan (plazmatositler), uygun transgenler ile (HML Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXN -GAL4 16, CRQ-GAL4 dahil H. Agaisse 16) ya da yiyici-GAL4 17; Kristal hücrelerinin nispeten küçük nüfusu etiketlemek için uygun hatlar BcF6-OBP ve GFP 18 veya (J. Pollock 19) tarafından lz-GAL4 vardır; etiketleme lamellocytes için, özel bir hücre tipi ağırlıklı olarak bağışıklık zorluklar ve yaralanma 13 tarafından uyarılan, örneğin, MSNF9mo mCherry 17 kullanılabilir. Bazı transgenik sürücüler farklı kan bir dizi olarak ifade edilmiştirTüm larva kan hücreleri 20 yaklaşık% 80 etiketler GAL4 20, – örneğin O gibi hücreler ve progenitorlar,. GAL4 sürücüler kullanıldığı yerlerde UAS-GFP veya başka bir floresan protein UAS-transgen ile kombinasyon gereklidir tüm durumlarda lütfen unutmayınız. Sonuçlar bölümünde, bu yöntem, larva gelişimi boyunca, kan hücre sayısı ve dolaşım davranışını izlemek için kullanılır.
(- 60 dak 30) 6 İkincisi, Hemosit Rahatsızlık Deneyi sonradan yeniden yapışması ve ev HPS sınırlı bir zaman çerçevesinde hemocytes yeteneği değerlendirilmesine olanak dış manipülasyon tarafından ikamet hemocytes ayırmak için tasarlanmış bir önceki adımı açıklanır. Tipik olarak, bu deney, her bir larva için hemocytes dolaşımdaki yüzdesini belirlemek için Boşaltma / Pençe Tahlili tarafından takip edilir. Biz vorteksleme wit göre rahatsızlık kullanan bu deneyi (Şekil 1D) için basitleştirilmiş bir protokol mevcuth cam boncuk, yerine boya fırçası ile tek larva manipülasyon önce 6 açıklandığı gibi. Sonuçlar bölümünde, bu deney hemolimf bu geçici müstakil hemocytes şamandıra göstermek için kullanılır ve hemocytes dolaşan fraksiyonunda elde edilebilir. Tahlil örn, çeşitli genetik geçmişleri veya stimülasyon koşullarının karşılaştırılması ikamet sitelere kendi hedef arama / yapışma hemocytes farklılıkları ölçmek için de yararlıdır. Bu mekanik manipülasyon geri çevrilebilir bir süreç yansıtır ve genellikle kısa bir süre 4,13 geri dönüşümlü olmayan enfeksiyon-veya hasar kaynaklı ikamet hemocyte seferberlik farklı olduğunu unutmayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, kantitatif tek Drosophila larva ikamet eden ve dolaşan kan hücrelerini kurtarmak ve bu iki hemocyte popülasyonlarının ölçmek için ilk yöntem açıklanmaktadır. Protokol görüntüleme ve otomatik hücre sayımı ile takip dolaşım yerleşik kan hücrelerinin ardışık salınmasını içerir. 60 dakika iyileşme süresi 6 – Larva ikamet hemocytes geçici, mekanik bozukluk dolaşıma büyük ölçüde 30 içinde ters olduğu bilinen bir süreç mobilize edilebilir. Bu duruma göre, bu protokol, iki şekilde test edildi: (1) larva ve larva gelişimi boyunca hemocytes dolaşan fraksiyonu için toplam hemocyte sayısı değerlendirerek, ve (2) deneysel olarak otomatik bir yöntem kullanılarak yerleşik hemocytes çıkartılmasından, doğruladı hemocyte lokalizasyonu ve resident hemocyte sayısı ve dolaşımdaki nüfusun sıkı ilişki. Buna ek olarak, yöntem tekrarlanabilirliği co ile gösterilmiştirbiyolojik çoğaltır iki veri setleri mparing.
Geçmişte, laboratuvarlar larva hemocytes 6,13,21 ölçmek için teknikler bir dizi kullandık. Bu protokol almak ve kolayca adapte platform sağlayan, Drosophila larva ikamet eden ve dolaşan kan hücre popülasyonlarının ölçmek için ortak bir standart kurar. Açıklanan yöntem ikamet hemocytes ve mikroçevresinin rolü odaklanmak çalışmalar için önemlidir, Hematopoetik 4-6 Cepler ve floresan proteini vahşi tip transgen taşıyan Drosophila suşları ve genetiği değiştirilmiş arka incelemek için uygundur. Protokol aynı zamanda ikamet hemocytes ya da (4 gözden) toplam hemocyte sayısındaki değişim seferberliğini tetikleyen immün meydan okuma veya yaralanma ve genetik veya çevresel kaynaklı sinyalizasyon sonra hemocyte seferberlik odaklanmak çalışmalar için geçerlidir. Bu prematüre di durumlarda, belirtmek gerekir kiLenf bezi soy karşı embriyonik / larva ayırt fferentiation ve lenf bezinden hemocytes bırakma, kullanılan floresan hemocyte muhabiri ifadesi deseni ile sınırlı olabilir.
Burada sunulan protokol görüntüleme canlı, floresan etiketli hemocytes dayanır. Gelecekte, bu immünsitokimya kullanarak, örneğin, tespit sonrasında serbest hücrelerin tespit edilmesini sağlamak için modifiye edilebilir. Yöntem, hemocytes alma ve işleme ex izin verdiğinden, bu durumda, iletişim kuralı yapışma inkübasyon sürelerini arttırarak ve bu konkanavalin A gibi, yapışkan kayıcı kaplaması ile, örneğin kan hücrelerinin bir yapışma sağlamak için adapte edilmesi gerekebilir in vivo, bu gelişim, hücre biyolojik ve biyokimyasal çalışmalar geniş bir fayda sağlayacaktır. Yerleşik ve dolaşımdaki kan hücreleri tüm Drosophila postembriyonik gelişim evreleri ve diğer omurgasızlar 22 suggesti sırasında bulunanng, bu yöntemin Adaptasyonun Drosophila larva hematopoietik sistem dışına çalışmalarda geniş bir fayda sağlayacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz sinek hisse senetleri için Jesper Kronhamn ve Dan Hultmark, Michael Galko ve Bloomington Menkul Kıymetler Merkezi'ne teşekkür ederiz. Istatistiksel analiz ile tavsiye için Courtney Onodera özel teşekkürler. Biz yazının eleştirel okuma Katrina Altın ve Kalpana Makhijani, Katrina Altın, Derynck laboratuvar üyelerine ve el yazması üzerinde tartışma ve yorumlar için Nystul laboratuvar üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma Atılım Biyomedikal Araştırma (PBBR), Geniş Merkezi, Hellman Vakfı, Amerikan Kanser Derneği RSG DDC-122595, Amerikan Kalp Derneği 13BGIA13730001, Ulusal Bilim Vakfı 1.326.268, Sağlık 1R01GM112083-01 National Institutes ve için UCSF Programı hibe ile desteklenmiştir (KB) 1R56HL118726-01A1.
Materials
| 6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
| Water squirt bottle | |||
| Metal spoon/spatula | |||
| Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
| Glass cavity dish | |||
| PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
| Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
| Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
| Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
| Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
| Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
| Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
| Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
| 2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
| Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
| Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
| Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5, 673-690 (2003).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Gold, K. S., Brückner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).
- Makhijani, K., Brückner, K. Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva. Fly. 6, 254-260 (2012).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Brückner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138, 5379-5391 (2011).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230, 243-257 (2001).
- Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. The two origins of hemocytes in Drosophila. Development. 130, 4955-4962 (2003).
- Sieweke, M. H., Allen, J. E. Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages. Science. 342, 1242974 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature immunology. 14, 986-995 (2013).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biology Open. 1-9, (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. eLife. , (2015).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).
- Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes. Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Gajewski, K. M., et al. Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila. Genesis. 45, 200-207 (2007).
- Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science. 288, 146-149 (2000).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).
- Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila. Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
