の血液細胞集団のアッセイ<em>キイロショウジョウバエ</em>幼虫

1.血球ブリード/スクレイプアッセイスライドの調製タイルスキャン機能なしの顕微鏡用オプション1：各幼虫を分析するために、顕微鏡の視野の表示領域に対応し、2mmの正方形それぞれ約5パップペンウェルを有する一枚のガラススライドを調製。それぞれに、S2メディア10μlの（ 図1A） -約5を追加します。乾燥から井戸を防止するために、湿ったチャンバー内にスライドしてください。 タイルスキャン機能付き顕微鏡用オプション2：各幼虫が分析されるためには、〜3の3〜4パップペンウェルを有する一枚のガラススライドの準備 – 4ミリメートルの正方形それぞれを;各ウェルに、S2メディア20μlの（ 図1B） -約15を追加します。乾燥から井戸を防止するために、湿ったチャンバー内にスライドしてください。 注：井戸の上記の推奨数は〜2.5、幼虫あたり最大3000血球の合計（後半2 番目の齢幼虫のために十分である- larvの大半を標識3mmの長さ、導入遺伝子アル血液細胞）。大きな血液細胞の数を評価する場合、複数のウェルを過剰混雑を避けるために必要とされるかもしれません。 幼虫のコレクション： 潮吹きペトリ皿に幼虫とフラッシュ幼虫を含むフライバイアルに水、またはペトリ皿に幼虫が含まれているいくつかの食品をスクープし、噴出ボトルを使用して、水で希釈します。 静かに絵筆を使用してペトリ皿の外に幼虫を選ぶとキャビティ皿にまたはコールドブロックのスライドに水の中に置きます。 注：幼虫は水また​​は低温のブロックに限られた時間のために保持することができます。幼虫死亡または血球上の望ましくない影響を避けるために、45分以内に試験片を使用しています。 解剖： 冷たい金属ブロック上に蛍光顕微鏡下で幼虫を選択します。必要に応じてサイズや画像の幼虫を測定します。 （「ブリード」）血球の循環の単離： 幼虫を選択したら、最初のPap-ペンウェル（ 図1Cに 1幼虫を置きます図2（a））。 幼虫の後部と前部両端に切開を作るために2きれいな針や解剖ハサミとピンセットを使用してください。常駐血球を乱さないようにするには、幼虫の腹側にこれらの切開を行うのがベストです。一貫性のある結果を得るために、すべての幼虫のために同じ場所に切開を行います。 1 回目の齢幼虫の場合は、（腹側前部で）1切開で十分です。 幼虫は、任意の圧力または物理的撹拌（ 図2A）を使用せずに数秒間出血することができます。 注：複数の幼虫に取り組んでいる場合には、サンプル「整合性に影響を与える可能性があまりにも長い間、氷上で幼虫を保つことを避けるために、次のステップに進む前に、それぞれのためにこれらの切開を行うことをお勧めします。 静かに針やピンセットで幼虫を持ち上げ、残りの循環血球を洗浄するために第2のウェルにそれを浸し。その後、常駐血球のリリースに従ってください。 <lI>常駐血球の分離（「スクレイプ」）： 静かに次のウェル（ 図2C）に幼虫を移します。 典型的には約1/3幼虫の前方端から配置され、幼虫の体壁を通って背側に蛍光を発することがある幼虫のリンパ腺を特定します。 （ 図2C）をパンクチャリングを避けるためにできるだけ近いリンパ腺に針で幼虫を下に固定することによって、常駐血球を放出しながらリンパ腺を避けます。 注：通常の開発時にリンパ腺の血球の成熟は幼虫血球に比べて遅れている、と差別化血球の蛍光レポーターは若い幼虫のリンパ腺の信号が表示されない場合があります。これらの例では、あまり注意が期待されているリンパ腺の血球によって区別蛍光標識された幼虫血球の無汚染としてリンパ腺に支払われる必要があります。 dissectiに常駐血液細胞をリリースこするおよび/または刺しのプロセスに。必要に応じて効果的にリンパ腺（上記参照）または他の身体部位の近くに幼虫を突き止めるために1針を使用します。血球を分離することを目指し、幼虫の体壁（ 図2C、E）を介して表示されている血球のクラスタでジャブする別の針を使用してください。血球はまた、掻き取り運動にリリースすることができます。しかし、早期の表皮を引き裂くことは自動化されたカウントがより困難にする可能性があり、血液細胞の大きなクラスターを放出することができます。 注：幼虫の年齢や遺伝子型に応じて、総血球数が異なります。単一細胞画像解析をより困難にする可能性があり、血液細胞といくつかのウェルの混雑を避けるために、いくつかのウェルの上に上述の解放処理を配布。 いくつかの血球が最終的な死体に残っている場合は、手動の数取器（ 図2E）の顕微鏡及び使用して観察することにより、これらの血球をカウントします。カウント、Pを容易にするために、同じスライドのきれいな領域にカーカスをレースや光学面の数を減らすためにできるだけ薄く、それを広めます。 細胞が落ち着く（必ずしも付着しない）するためのウェルを画像化する前に10分 – 解剖が完了すると、5の間待ちます。定住血球を乱す可能性がある、乾燥を避けるために、湿ったチャンバ内でスライドをインキュベートし、スライドの乱暴な取り扱いを避けます。 注：血球数を決定する際に、放出された細胞が固定されていないと細胞は幼虫から放出された後すぐに解剖した後、好ましくは30分以内に画像化されなければなりません。ウェル中の媒体の光学面を通って焦点を合わせることによって確認されるべきである10分、 – 培地および細胞の特性の量に応じて、細胞の大部分は5で決済しているだろう。しかし、血液細胞の一部のみが、この時点で、スライド表面に細胞固定ベースは、このプロトコルを修正する場合に考慮される必要があるという事実に付着してしまうapproache秒。 定量化： 蛍光顕微鏡（ 図2B、D、F）の下で定住血球の画像を取ります。 ImageJソフトウェアを使用して、血球の定量化に従ってください。 ImageJの細胞計数アルゴリズムのためのイメージを準備します。 よくImageJのを使用してのオープン画像：→オープン→（ファイルを探し、選択を）ファイル。 画像（複数可）は、8ビットまたは16ビットであることを確認してください。その後、 しきい値を調整し、選択をクリックし画像を選択することにより、画像のしきい値を調整します。 「しきい値ウィンドウ」（ 図3A）を確認します。 「 暗い背景 」オプションをチェックします。 「 赤」を選択し、画像の各セルは赤い点（グレースケールで見られます覆われていない細胞; 図3B）でマークされるまで（黒い矢印参照） より低い閾値レベルを上げます 。 下限しきい値として一部のセルがマークされていないになります増加しています。これは 、低しきい値を設定するどのくらいのための指標となり得ます。 注：時々細胞のクラスターが解決できず、パーティクルカウンタで一つに数えられるでしょう。そのような例では、クラスタ内のセルの数は、数取器を使用して、画像（必要に応じてズームイン）と手動カウントを調べることによって推定することができます。代替的に、 下限しきい値細胞のクラスターを解決するために増加することができます。この操作に起因する任意のマークされていない細胞は、その後数取器を用いて計数することができます。 ImageJのを用いて細胞数を分析します。 細胞（ 図3C）をカウントするパーティクルアナライザーを起動します。 分析選択して、 粒子の分析をクリックします。必要に応じて粒子にアルゴリズムの数（ 図3D）を参照するには、「 オーバーレイアウトライン」を選択します。また、ユニットのサイズまたはピクセルの領域に制限を設定します（ 例：、細胞、アルゴリズムの細胞など）の塊をカウントします。 [OK]をクリックします 。カウント（ 図3E）と要約ウィンドウを確認します。 2.血球妨害アッセイ血球、選択幼虫を妨害し、ガラスビーズ（212から600ミクロン）の約0.5グラムを2ミリリットルの微量遠心管にそれらを配置するには0.5mlの水を加えます。 1分間の速度10で、手で、チューブをボルテックス。 ペトリ皿にマイクロチューブの内容物がこぼれると絵筆で幼虫を選択することによりガラスビーズから幼虫を取得します。 回復期には、フライ食品の少量を使用して、以前に作成したペトリ皿に幼虫を置きます。幼虫は45分のまたは所望に応じて期間のために彼らの血球パターンを再確立することを許可します。 注：彼らはプロセスで死亡しているように、移動を停止しているすべての幼虫を捨てます。しかし、我々は一般的にはLを参照してくださいボルテックスの1分後ittle損傷（以下を参照し、 補足図1）。 第1節で前述したように、回復期間の後、ブリード/スクレイプアッセイを続行します。