Testen Bloedcel Populaties van de<em> Drosophila melanogaster</em> Larva
Summary
Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
Abstract
In gewervelde dieren, wordt hematopoiesis gereguleerd door inductieve micro-omgevingen (niches). Ook in de ongewervelde modelorganisme Drosophila melanogaster, inductieve microenvironments bekend als larvale Hematopoëtische Zakken (HP's) zijn geïdentificeerd als anatomische plaatsen voor de ontwikkeling en regulering van de bloedcellen (hemocytes), in het bijzonder van de zelfvernieuwende macrofaaglijn. HPs zijn segmentaal herhaalde zakken tussen de epidermis en de spierlagen van de larve, waarvan ook sensorische neuronen van het perifere zenuwstelsel. In de larve, zijn resident (zittend) hemocytes blootgesteld aan anti-apoptotische, lijm en proliferatieve signalen van deze sensorische neuronen en mogelijk andere componenten van de HPs, zoals de voering spieren en epitheliale lagen. Tijdens de normale ontwikkeling, de geleidelijke afgifte van ingezeten hemocytes van de HPs brandstoffen de bevolking van circulerende hemocytes, die culmineert in de release van de most van de bewoner hemocytes begin metamorfose. Immuunsysteem aanvallen, lichamelijk letsel of mechanische storing leiden tot de voortijdige vrijlating van ingezeten hemocytes in omloop. De schakelaar van larvale hemocytes tussen ingezeten locaties en de bloedsomloop verhoogt de noodzaak van een gemeenschappelijke norm / procedure om selectief te isoleren en te kwantificeren deze twee populaties van bloedcellen uit enkele Drosophila larven. Derhalve is dit protocol beschrijft een geautomatiseerde methode om los te laten en te kwantificeren van de bewoner en circulerende hemocytes van enkele larven. De werkwijze faciliteert ex vivo technieken, en kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid van ontwikkelingsstadia van Drosophila en andere ongewervelde organismen dienen.
Introduction
Onderzoek in de ongewervelde model Drosophila melanogaster is de ontdekking van aangeboren immuniteit 1 gereden, en heeft het begrip van de verschillende aspecten van bloedcellen ontwikkeling 2-4. Drosophila hematopoiesis kan worden onderverdeeld in de lijn van embryonale / larvale hemocytes, van oorsprong uit de vergemakkelijkt embryo en uit te breiden in de larve en het geslacht van lymfeklier hemocytes 4,5. Hier presenteren we een protocol dat zich richt op de lijn van embryonale / larvale hemocytes, die in de Drosophila larven bestaat hoofdzakelijk plasmatocytes (macrofagen) en enkele kristallen 4 cellen. In de larve, hemocytes van het embryo blijven bestaan en koloniseren segmentaal herhaald en terminal Hematopoietische Pockets (HP's) zich tussen de opperhuid en de spieren lagen van het larvale lichaam muur 5,6. Op basis van hun natuur als zelf-vernieuwing macrofagen 6, hun overheersende verblijf in de lokale weefsel microenvironments 6, 7 en hun afstamming van de vroegste bloedcellen ontstaan tijdens de ontwikkeling 6,8, dit bloed celpopulatie wordt geacht vergelijkbaar vertebrate zelf-vernieuwing weefsel macrofagen, onafhankelijk myeloïde recent geïdentificeerd in verschillende soorten 4,9,10. In Drosophila, sommige of al deze resident cellen tonen ook plasticiteit tot andere soorten bloedcellen te voorzien kristalcellen 11,12.
Larvale hemocytes zijn overwegend inwoner (zittend), maar zijn in een dynamische steady-state tussen verschillende HP's. Ze worden geleidelijk vrijgegeven in het verkeer, in het bijzonder met de larve 3 e instar benadert verpopping 5-7. Immuun uitdagingen, letsel of mechanische storing leiden tot een voortijdige, in het laatste geval omkeerbaar, mobilisatie van de bewoner hemocytes in de hemolymfe 4,6,13.
Eerdere studies hebben die inwoner voorgesteld en circulerendelarvale hemocytes zijn van hetzelfde geslacht, maar verschillen in hun lijm of homing eigenschappen 6,7,13,14. Selectieve isolatie van circulerende versus inwoner hemocytes onthuld verhoogde niveaus van proliferatie in de bewoner hemocyte bevolking, suggereert hun blootstelling aan inductieve signalen van de HP's 6. Drosophila larvale HPs worden omzoomd door opperhuid en de spieren lagen en verder haven sensorische neuron clusters van het perifeer zenuwstelsel (PNS) en leverfunctie die lijkt oenocytes 6. Functioneel zijn mutante cellen en genetische ablatie experimenten toonden aan dat sensorische neuronen in de HPs ondersteunen trofische voortbestaan en lokalisatie van larvale hemocytes 6.
Hier beschrijven we een werkwijze voor het specifiek isoleren en kwantificeren van inwoner circulerende hemocytes uit één Drosophila larven, en een protocol voor mechanische hemocyte mobilisatie. De werkwijzen kunnen worden gebruikt voor het ex vivoonderzoek hemocytes en kan verder worden aangepast aan andere ontwikkelingsstadia Drosophila zoals de pop en volwassen en andere ongewervelde systemen. Aangezien eerdere studies geen onderscheid tussen ingezeten en circulerende hemocytes, dit protocol voorziet in een gemeenschappelijke norm voor de studie van ingezeten bloedcellen en zal helpen om de consistentie van ongewervelde bloedcellen onderzoek te verhogen.
Ten eerste, de hemocyte Bleed / Schraap Assay beschrijft het differentieel isolatie en geautomatiseerde kwantificering van fluorescerend eiwit gemarkeerd resident en circulerende hemocyte populatie van enkele Drosophila larven; Het protocol biedt twee opties voor regelmatige en tegel scannen uitgeruste microscopen (figuur 1). Dientengevolge, het percentage circulerende hemocytes en het totale aantal hemocytes per larven verkregen. De methode is gebaseerd op transgene Drosophila larven die fluorescerend eiwit tot expressie brengen onder hun bloedcelbevolking. De keuze van de hemocyte bestuurder of journalist bepaalt de uitkomst, dat wil zeggen, dat de bevolking van bloedcellen wordt gevisualiseerd en gekwantificeerd. Om vooral label macrofagen (plasmatocytes), waarvan de overgrote meerderheid van de bewoner en de circulerende hemocyte bevolking van de Drosophila larve 6 omvatten geschikte transgenen omvatten Hml Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXn -GAL4 16 CRQ-GAL4 (door H. Agaisse 16) of GAL4-eter 17; voor het labelen van de relatief kleine populatie van kristal cellen, geschikt lijnen zijn BcF6-GVB en GFP 18 of LZ-GAL4 (door J. Pollock 19), voor de etikettering lamellocytes, een gespecialiseerd celtype voornamelijk veroorzaakt door het immuunsysteem uitdagingen en verwondingen 13, bijvoorbeeld MSNF9mo-mCherry worden gebruikt 17. Sommige transgene drivers worden uitgedrukt in een bereik van gedifferentieerde bloedcellen en voorlopers, zoals hij – GAL4 20, die ongeveer 80% van alle larvale bloedcellen 20 labels. Houdt u er rekening mee dat in alle gevallen waarin GAL4- drivers gebruikt worden, samen met UAS-GFP of een ander fluorescerend eiwit UAS-transgeen is vereist. In de sectie Resultaten, wordt deze methode gebruikt om te controleren bloedcellen aantal en de circulatie gedrag in de loop van de larvale ontwikkeling.
Ten tweede, de bloedbestanddelen Verstoring Assay beschrijft een voorafgaande stap ontworpen resident hemocytes los door externe manipulatie, die vervolgens kan de evaluatie van het vermogen van hemocytes opnieuw hechten en thuisbasis HPs binnen een kort tijdsbestek (30 – 60 min) 6. Meestal deze test wordt gevolgd door de ontluchting / Schraap Assay het percentage circulerende hemocytes per larve bepalen. We presenteren een vereenvoudigde protocol voor deze test (figuur 1D), die verstoring gebruikt door vortexen with glasparels in plaats van manipulatie van één larve met een kwast zoals eerder 6 beschreven. In de sectie Resultaten, wordt deze test gebruikt om die kortstondig vrijstaande hemocytes vlotter in de hemolymfe demonstreren en kan worden teruggevonden in de fractie van circulerende hemocytes. De test is ook nuttig om verschillen in hemocytes hun homing / hechting aan locaties resident, vergeleken bijvoorbeeld verschillende genetische achtergronden of stimuleringscondities kwantificeren. Houdt u er rekening mee dat deze mechanische manipulatie weerspiegelt een omkeerbaar proces en verschilt van Infectie of letsel veroorzaakte inwoner hemocyte mobilisatie, die doorgaans niet omkeerbaar in een kort tijdsbestek 4,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we de eerste methode kwantitatief recupereren inwoner circulerende bloedcellen uit één Drosophila larven en kwantificeren beide hemocyte populaties. Het protocol bestaat uit de opeenvolgende release van circulerende en resident bloedcellen, gevolgd door beeldvorming en geautomatiseerde cel tellen. Larvale bewoner hemocytes kan kortstondig worden gemobiliseerd in omloop door mechanische storing, een proces dat bekend is dat een groot deel worden teruggedraaid binnen een 30-60 min herstelperiode 6. Dienovereenkomstig werd dit protocol getest op twee manieren, (1) door beoordeling van de totale hemocyte aantal per larve fractie van circulerend hemocytes de loop van larvale ontwikkeling en (2) van experimenteel losmaken resident hemocytes toepassing van een geautomatiseerde werkwijze, die bevestigd strakke correlatie van hemocyte lokalisatie en hemocyte nummer in de bewoner en de verspreiding van de bevolking. Bovendien is de reproduceerbaarheid van de methode werd aangetoond door comparing twee datasets van biologische herhalingen.
In het verleden zijn diverse laboratoria technieken voor larvale hemocytes 6,13,21 kwantificeren. Dit protocol voorziet in een gemeenschappelijke norm op te halen en te kwantificeren resident en circulerende bloedcellen populatie van Drosophila larven, die een makkelijk aanpasbaar platform. De beschreven methode is essentieel voor studies naar de rol van de bewoner hemocytes en hun micro-omgeving, de hematopoietisch Zakken 4-6, en is geschikt voor fluorescent eiwit-dragende transgene Drosophila stammen in wild type en genetisch gemodificeerde achtergronden bestuderen. Het protocol is ook relevant voor studies die zich richten op hemocyte mobilisatie na immuun uitdaging of letsel, en genetisch of ecologisch geïnduceerde signalering dat de mobilisatie van de bewoner hemocytes of veranderingen in totaal hemocyte aantal (beoordeeld in 4) activeert. Opgemerkt wordt dat in het geval van voortijdige differentiation en afgifte van hemocytes uit de lymfeklier, onderscheiden embryonale / larvale versus lymfeklier lijnen kan worden beperkt door het expressiepatroon van de fluorescente reporter hemocyte gebruikt.
De hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op imaging levend, fluorescent-gelabelde hemocytes. In de toekomst kan het worden gewijzigd om de detectie van vrijgekomen cellen mogelijk na fixeren, bijvoorbeeld met behulp van immunocytochemie. In dit geval moet het protocol worden aangepast om volledige hechting van de bloedcellen, bijvoorbeeld door verhoging adhesie incubatietijden en toevoeging klevende glijbekleden zoals concanavaline A. Daar de werkwijze maakt ophalen van hemocytes en hun manipulatie ex vivo, het zal profiteren van een breed scala van ontwikkelings-, celbiologische en biochemische studies. Resident en circulerende bloedcellen worden gevonden tijdens alle postembryonic ontwikkelingsstadia van Drosophila en andere ongewervelden 22, suggesting dat de aanpassing van deze methode zullen profiteren van een breed scala van studies buiten de Drosophila larvale hematopoietische systeem.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Jesper Kronhamn en Dan Hultmark, Michael Galko en de Bloomington Stock Center for the fly voorraden. Speciale dank aan Courtney Onodera advies met statistische analyse. Wij danken Katrina Goud voor kritische lezing van het manuscript, en Kalpana Makhijani, Katrina Gold, de leden van de Derynck laboratorium, en leden van de Nystul laboratorium voor discussie en commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de UCSF Programma voor Doorbraak Biomedical Research (PBBR), Brede Center, Hellman Foundation, American Cancer Society RSG DDC-122.595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1.326.268, National Institutes of Health en 1R01GM112083-01 1R56HL118726-01A1 (naar KB).
Materials
| 6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
| Water squirt bottle | |||
| Metal spoon/spatula | |||
| Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
| Glass cavity dish | |||
| PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
| Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
| Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
| Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
| Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
| Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
| Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
| Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
| 2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
| Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
| Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
| Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5, 673-690 (2003).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Gold, K. S., Brückner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).
- Makhijani, K., Brückner, K. Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva. Fly. 6, 254-260 (2012).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Brückner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138, 5379-5391 (2011).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230, 243-257 (2001).
- Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. The two origins of hemocytes in Drosophila. Development. 130, 4955-4962 (2003).
- Sieweke, M. H., Allen, J. E. Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages. Science. 342, 1242974 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature immunology. 14, 986-995 (2013).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biology Open. 1-9, (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. eLife. , (2015).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).
- Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes. Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Gajewski, K. M., et al. Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila. Genesis. 45, 200-207 (2007).
- Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science. 288, 146-149 (2000).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).
- Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila. Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
