表面EBL作製したナノ構造基板を用いた生体分子のラマン分光検出の強化

溶液中の遊離タンパク質と金属含有基材を使用せずに、溶液中または粉末形態のフリーのリガンドを含む、主要な構成要素のための制御ラマンスペクトルを収集し、解釈のために、ならびに適切な比較を可能にすることが重要である。 図5Aは、典型的なラマン提示ナノ構造の基材なしのガラススライド上にDI水の中の遊離プロテインAのスペクトル。最高ラマン強度を持つ2つのバンドが、2931センチメートルのバンドは-1と1091センチメートル-1、それぞれ、CHとCS結合を含む振動に対応しています。 563センチメートル-1 1450 -1、1653センチメートル-1及び2426センチメートル-1のような低いラマン強度を有する他のバンドは、振動モード18,32,33,34の重畳に起因し得る。三つの異なる濃度、0.3、0.9及び1.3mMの有する緩衝溶液中のリガンドフリーGPBの制御ラマンスペクトルは、 図5Bに示されている。 T IN彼は3400センチメートルまわり、広い帯域を把握-1 2935センチメートルのバンドのに対し、溶剤35に対応して-1タンパク質32,33のCH結合を含む振動を表す。 図5Cは、中にD-グルコースのための高い波長のラマンスペクトルを示す異なる濃度のために緩衝液：1、6、100、200、及び400 mMの。グルコースの濃度が増加すると、C-H結合の振動帯は2890センチメートル-1及び2960センチメートル-1で生じる。 532 nmおよび780 nmの励起波長の両方で得られた結晶形でのドーパミンの制御ラマンスペクトルを図5Dに示されている。ラマンスペクトルの多くは、ベンゼン環曲げ及び分子19,36のCH結合のストレッチから来ている。約3,000 -1におけるバンドのいくつかは、-1だけ532nmではなく、780 nmの励起波長で観察される。 PLOAD / 52712 / 52712fig5.jpg "/> DI水中のプロテインAの図5の制御ラマンスペクトルは532nmの励起波長18（A）で得られた。緩衝溶液中のリガンド遊離グルコース結合タンパク質のラマンスペクトルは、532 nmの励起波長（B）で得られた。緩衝溶液中のD-グルコースのラマンスペクトルは、532 nmの励起波長（C）で得られた。ドーパミン粉末のスペクトルは、532 nmおよび780 nmの励起波長19（D）で得られた。全てのスペクトルは、ナノ構造の基材なしでガラススライド上に溶液のラマンスペクトル（a、b、c）を、粉体（d）は規則的である。 （D）においては、様々な分子振動のラマンシフトレジームの割り当ては、他の場所19に詳述するように一般的な原子分子の電子構造システム（GAMESS）30とMacMolPlt 31ソフトウェアを用いて行った。 18 AMERICから許可を得て転載パネル（A）真空協会。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ステップ1-3で説明したように、表面固定化生体分子のためのSERSスペクトルを得るためには、溶融シリカ担体上に金属ナノ構造を含む基板が製造される。作製した基板の品質は、走査型電子顕微鏡（SEM）を使用して監視される。標準的なSEM手順は他の場所16,17,18、19ず、本プロトコールに含ま記載されている。 図6に示す代表的なSEM構造（パネル広告）等のAuおよびAgナノドット、ナノ六角形の画像、ならびに非図 -structured AuとAgのパッド（それぞれ、パネルeおよびf）。次のステップは、 表1に記載されている3つのデザインを採用したナノ構造化基板上の生体物質の固定化、およびそれらのSERSスペクトルの収集を伴う。 O中ラマンイメージング中に水性環境を維持するRDER、各サンプルは、対応する溶液中に配置され、図7に示すように、薄いガラスカバーで蓋をし ​​、密封し、（ 表1参照）。 図6の走査型電子顕微鏡（SEM）SERS基板として用い、厚さ10nmのAuとAg表面のナノ構造の画像（A、B）ナノドットのアレイ。 （C、D）ナノ六角形のアレイ。 （E、F）構造化されていないパッド。 Agの構造（右）との基板はFS上の厚さ10nmのNiコーティングを使用するのに対し、Auの構造（左）と基材は、FSのサポー​​トを採用。他の箇所16,17,18に記載されるような画像が得られた。PG "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 溶液中の生体機能を有するサンプルのラマンイメージング用防水室の図7.スキーム。 デザイン1において、組換えタンパク質Aは、脱イオン水18で11-メルカプトデカン酸（MUA）の自己組織化単分子層で官能基材上に固定される。この設計では基板は（ 図6Aおよび図8参照）が50nmピッチでのAuドットの3つの配列を含み、溶融シリカ上のドット間の距離を変化させる。タンパク質の固定化のプロセスは、基板上のSAMの形成で始まる。 SAMとタンパク質との間の共有結合を得るために、SAMのカルボン酸基は、Nの混合物で処理することにより、アミン反応性NHSエステルに変換される</em>の-エチル- N ' – （3-（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（EDC）溶液およびDI水中のNヒドロキシスクシンイミド（NHS）溶液。プロテインAの固定化は、タンパク質37のリジン残基によりNHS基の置換により起こる。 Auのナノ構造体上に固定化プロテインAを使用したデザイン1用撮像サンプルの例を図9に示されている。（ 図9（a）は、別のドット間の隙間と、生体機能を有する金ナノドットの3つの配列を含むサンプルの光学顕微鏡像を示すまた、 部3Aaと8）を図 、および図9Bは 、これらのアレイ上のラマンスペクトルマッピングを示しています。それは、最高のラマン強度の低い強度が最も広いドット間のギャップを有する配列IIIについて得られるのに対して、Iは、ドット間の隙間が狭くている配列のために発見されたことが分かる。これは、より高い電気情けないによって生成強いプラズモンカップリング効果によって説明することができるドット18の間の狭いスペースでのLDS。 図9Cは、配列IおよびIIに対して得られた最強のSERSスペクトルを示す。スペクトルは、 図5Aに見られる溶液中の遊離プロテインAのラマンモードの近くにいくつかのバンド（1630センチメートル-1、1964センチメートル-1、2280センチメートル-1、2577センチメートル-1、および2916センチメートル-1）を示す。タンパク質中に見られる様々な債券の振動に起因する、これらのバンドは、両方の固定されたタンパク質で、その溶液中で同様の場所に表示され、または固定化された時、わずかにやや高い波数にシフトしているのどちらか。これとは対照的に、タンパク質なしにMUA SAMによって官能類似のナノ構造基板のSERSスペクトルは、 図9は、表面固定化プロテインAのSERSマッピングを表していることを確認した、全く異なるパターン18を示 ​​して見るにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。 図デザイン1 18で使用されるFS基板上のAuナノドットの3つの配列の8 SEM像。配列は、ドット間のギャップの幅が異なる結果として、同じ50nmのピッチと若干異なるドット半径を持っている。これは、3つのアレイのためのPMMAマスクを生成するために異なるEBL露光量を適用することによって達成される（ 表1参照）。より高い被ばく線量はメタライゼーションとリフトオフ後に、より大きな金のドットサイズを可能に、PMMAマスクより広い穴になる。 18米国真空学会から許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 レ/ ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg "/> デザイン1 18における基板固定プロテインAの図9 SERSイメージング。溶融石英基板上に50nmのピッチと異なるドット間の隙間のAuナノドットの3つの配列を含む（A）試料の光学顕微鏡像、（参照図6）は 、生体機能を有する、図3Aに示すように（B）サンプルのラマンマッピング。ドットアレイIおよびIIから（C）SERSスペクトル。パネル（B）において、縦軸は、基板を横断する距離を表し、横軸はラマンシフトを示し、凡例バーはラマン強度を示している。垂直パネル内のパネルのライン（B）及び（C）溶液中で遊離プロテインAのベンチマークラマンバンドを表す（*）は、破線（C）は 、アレイI.ラマンスペクトルからのSERSバンドを示し、532nmの励起を得た。波長。 18米国真空学会から許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 デザイン2で、D-グルコース（リガンド）と複合体を組換え糖結合タンパク質（GBP）21は、リン酸カリウム緩衝液中で、適切な基質上に固定化される。固定化リガンドを含まないGBPを有する試料も比較のために用意されている。この設計では、グルコース結合タンパク質は、貴金属6にはNiによく結合ではなくヒスチジンタグを用いて表面に取り付けられている。基板は、Agナノドット、ナノ六角形、及びNiコーティングされたFSに構造化されていない銀のパッド（それぞれ、 図6B、6D、および6F）のアレイを含むので、一方が固定化されたタンパク質分子の大部分の間の隙間に配置されることを期待することができニッケルコーティングがavがあるAgのナノ構造ailable。ラマンスペクトルは、固定化された無グルコース及びグルコース結合GBPについて得られた、それぞれ、 図10Aおよび10Bに示されている。すべてのこれらのスペクトルは、約緩衝液35に対応する3300センチメートル-1、広い帯域を示す。構造化されていない銀パッドで得られたスペクトルは、この単一のバンドを含み、そして予想通り、固定化タンパク質は、Ag表面上に見出されていないことを確認し、任意のタンパク質の振動モードを示していない。これとは対照的に、スペクトルは、Agナノドットと1550センチメートル-1と2900センチメートル周りにナノ六角形の展示バンド-1、分析対象物32,33を表すの配列を用いて得られる。具体的には、広帯域の周り1550センチメートル-1、アミドIIバンドとして知られている、タンパク質33,34で結合が振動ペプチドすることによるものである。と考えた場合に、このバンドは、Agの特徴との間のNi表面上に固定化されたGBPの振動モードの重畳を表すナノドット又はナノ六角形を含有する基質を使用した場合の、とは、貴金属ナノ構造体の近傍のこれらのモードのSERS増強を示す。このバンドは、結合タンパク質のために利用可能なNi表面なし銀パッド上SERS増強（ 図5B）及び不在の不在下で溶液中のタンパク質のための非常に弱いが、それは、タンパク質のためのアクセス可能ないくつかのNi表面を有するナノ構造の基材のために顕著であるバインドします。しかし、さらに重要な本研究のためには、他の、狭いバンドの周りに約2900センチメートル-1 CH結合wibrations 32,33に起因することができます。グルコースを含まないGBPのスペクトルは2933センチメートル-1ナノ六角形基板（ 図10A）と類似した波長のナノドット基板、および、弱いが識別可能なバンドでの顕著なバンドを示す。グルコース自由なタンパク質の場合とは異なる、グルコース結合GBPのSERSスペクトルは、 ふぃぎゅに示す 2850センチメートル-1と2910センチメートル-1に、債券の振動体制をCHに対応する図10（b）の展示再二つのバンド。バンドはよくナノ六角形基板上のグルコース結合GBPのスペクトルに顕著である、と彼らはまた、ナノドット基板上のGBPのスペクトルで見ることができる。 2850センチメートルのバンドは他のバンド-1に対し（2910センチメートルで、2890センチメートルに適度に近い-1つのソリューションのD-グルコースからの制御ラマンスペクトルであるため、それがタンパク質に結合したグルコースに起因することができる-1）タンパク質及びグルコースの両方のCH結合の振動に起因している。一つは、グルコースを含まないとグルコース結合基質固定化GBPからSERSシグネチャの違いを結論付けることができ、この領域で観測可能で、タンパク質結合グルコースのCH結合の振動が説明した設計を採用した検出可能である。 10.JPG "/> リガンドフリー（A）の図10. SERSスペクトルとデザイン2で3異なる基板上に固定化されたリガンド結合（B）グルコース結合タンパク質 。スペクトル。780 nmの励起波長を用いて得られた拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。 設計3は、チオール終端23と、カスタマイズのドーパミン結合アプタマー（DBA）は、トリス、基板（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）緩衝液で固定し、ドーパミンは、その後、固定化アプタマー19に結合されている。この設計のための基質は、FS（ 図6C）上のAuナノ六角形の配列を含む。構造化されていない金パッド（ 図6E）は 、制御目的のために使用される。 DNAは本質的に蛍光性であることから38、780 nmの励起waveleng thは、この要因を減少させるために設計3で使用されている。この設計では、認識要素（アプタマー）は、ドーパミン、この領域における重要なラマン活性を示し、一方、 図11において考慮ラマンシフトの領域の活性ラマンない。固定化されたアプタマーなしドーパミンのみに曝露した試料からのシグナルが19ない結果ドーパミンバンドを示さないので、観測されたSERSバンドがアプタマーに結合したドーパミン由来すると予想される。 図11は、添加前と後の金ナノ構造体上の固定化されたアプタマーのSERSスペクトルを比較するドーパミン。予想されたように、固定化されたドーパミンのないアプタマーは、ラマンバンドを示さない。対照的に、顕著なラマンバンドの数は、ドーパミン結合固定化アプタマーについて観察される。 図11の中で最もバンドの位置は、振幅の違いはあるものの、結晶質のドーパミンのものに近い。 igure 11 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg "/> リガンドフリー（パープルライン）の図11. SERSスペクトルとデザイン3 19中のAuナノ六角基板上に固定化されたリガンド結合（青線）ドーパミン結合アプタマー。赤い線は、ドーパミン粉末の制御SERSスペクトルを示す。 してくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。