Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Robert F. Peters; Luis Gutierrez-Rivera; Steven K. Dew; Maria Stepanova

doi:10.3791/52712

JoVE Journal > Engineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Engineering

משטח משופר ראמאן ספקטרוסקופיה איתור של מולקולות ביולוגיות באמצעות EBL מצעי Nanostructured המפוברק

Published: March 20, 2015

doi:

10.3791/52712

Robert F. Peters^1,2, Luis Gutierrez-Rivera^1,2, Steven K. Dew^1,2, Maria Stepanova^1,2

¹Department of Electrical and Computer Engineering,University of Alberta, ²National Institute for Nanotechnology,National Research Council of Canada

Summary

We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.

Abstract

ייצור ואפיון של מערכות ננו-ביולוגי המצומד ממשק ננו המתכתי על תומך מוצק עם מולקולות ביולוגיות משותקות מדווח. הרצף השלם של צעדים ניסיוניים רלוונטיים מתואר, הכולל ייצור של מצעי nanostructured באמצעות יתוגרפיה אלומת אלקטרונים, חוסר תנועה של מולקולות ביולוגיות על מצעים, ואפיונם ניצול-ראמאן ספקטרוסקופיה משופר קרקע (SERS). שלושה עיצובים שונים של מערכות ננו-ביולוגי מועסקים, כוללים חלבון, חלבון קושר גלוקוז, וaptamer DNA דופמין מחייב. בשני המקרים האחרונים, הכריכה של ligands בהתאמה, D-גלוקוז ודופאמין, כלול גם. שלושה סוגים של מולקולות ביולוגיות הם משותקים על מצעי nanostructured בשיטות שונות, ואת התוצאות של ההדמיה SERS מדווחות. היכולות של SERS כדי לזהות מצבי רטט מחלבונים-משותק פני השטח, כמו גם כדי ללכוד את החלבון ליגנדaptamer ליגנד ד כריכה הם הפגינו. התוצאות גם להמחיש את ההשפעה של הגיאומטריה ננו-מבנה פני השטח, אסטרטגית קיבוע מולקולות ביולוגית, פעילות ראמאן של המולקולות ונוכחות או עדר של יגנד מחייב את ספקטרום SERS רכש.

Introduction

יכולות לפתח ולאפיין מערכות ננו-ביולוגי המצומד ממשק ננו מוצק ופולימרים ביולוגיים הופכות להיות חשובות יותר ויותר להתקדמות נוספת בטכנולוגיות של הדור הבא ביו-חישה וביו-actuation ^1,2. זה כרוך לימודים רב-תחומיים על פני מספר תחומי מחקר, כגון הייצור של רכיבים רלוונטיים של מצב מוצק (אלקטרודות מיקרו או ננו, ציפוי ננו-הנדסה, ננו-חוטים, או חלקיקים) ^2,3,4; חוסר תנועה של מולקולות ביולוגיות על המשטחים ליצור bioconjugates הרצוי ^5,6,7; וניטור ממשקי ננו-ביולוגי ^1. ברוב המקרים, את הבחירה של ייצור אופטימלי, ביו-functionalization, ושיטות אפיון היא בין-קשורה מאוד. ברור, הבחירה של טכניקות nanofabrication תהיה מונעת על ידי הדרישות של רכיבי מצב המוצק של המערכת, להיות תלוי במידה רבה בשיטת זיהוי, אשר בturn נקבע על ידי הטבע של biopolymers המעורב והמטרה של ניטור הממשק.

מתוך מגוון רחב של טכניקות מיושמות לאפיין מערכות bioconjugate ^1,3, ספקטרוסקופיה המשטח המשופר ראמאן (SERS) התגלה כשיטת מבטיחה ביותר לגילוי של מינים כימיים וביולוגיים על משטחים ^8,9,10,11. SERS מעסיק פיזור קשיח של אור מונוכרומטי על ידי מולקולות ביולוגיות-משותק פני השטח (איור 1) ומאפשרות את לכידתו של חתימות ייחודיות המתאימות לתנודות מולקולריות. יכולת זו כדי להבדיל בין מולקולות שונות מבלי לערב תוויות, כימיה מורכבת, או צעדים גוזלים זמן, עושה SERS שיטת פוטנציאל מאוד יעילה של ביו-זיהוי. יתרון חשוב נוסף של SERS הוא הרגישות הגבוהה שלו. העירור של plasmons משטח המקומי על ידי אור אינטראקציה עם ננו האצילי מתכת (מצעי SERS) מגדיל באופן דרמטי intensity של פיזור ראמאן ידי אנליטי, המאפשר זיהוי של כמויות קטנות מאוד של מולקולות, מmonolayers אל גבולו המולקולה בודדת ^8,9,10,11. לבסוף, רוב המולקולות ביולוגיות דורשות תמיסות מימיות להיות יציב. בגלל מים לעתים קרובות יש פעילות ראמאן מוגבלת, אות רקע מדגימות מימיות ממוזערת ^9. יישומים של SERS הציגו גידול מעריכי בעשור האחרון ^10. עם זאת, אתגר הרבה דן בSERS הוא שהשיפור האלקטרומגנטי של פיזור ראמאן תלוי באופן קריטי על הגודל, צורה, והמרווח של ננו המתכת שבו גלי plasmonic מושרים ^11,12,13. על מנת להשיג מדידות SERS יעיל לשחזור, שליטה על נדרשת הגיאומטריה המצע בממדים ננומטריים.

איור 1. Scheme של ספקטרוסקופיית ראמאן משופר פני השטח.

שיטות רבות המועסקות לפברק מצעי SERS ^11,12,13 ניתן לסווג באופן גס לשיטות מלמטה למעלה ומלמעלה למטה. שיטות מהסוג הראשון להעסיק תהליכים שונים של הרכבה עצמית או סינתזה כימית מכוונת כדי לייצר ננו. לעתים קרובות התייחס דוגמאות כוללות קיבוע של חלקיקי monodisperse על תומך מוצק ^11,12,13, תרמית, גמגום, או בתצהיר אלקטרוכימיים של סרטי מתכת מחוספסים ^11,12, ושיטות סינתזה כימיות שונות ^13. למרות טכניקות כגון נוטות להיות יחסית פשוט וזול, רובם מאותגרים על ידי חוסר שליטה על המיקום של המבנים, ושחזור מדגם למדגם מצומצם.

בניגוד לכך, טכניקות ליתוגרפיה מלמעלה למטה להעסיק מכשירי manipulable כגון קורות חלקיקים כדי ליצור דפוסים הרצויים על משטחים. אחד משמש לרובשיטות nanolithography, ליתוגרפיה אלומת אלקטרונים (EBL), מציעה שליטה נהדרת מעל כוללת עד מתחת ל -10 nm וגם גמישות כדי לאפשר לעיצובי מצע שונים על תומך מוצק ^11,12. בEBL, אלומת אלקטרונים ממוקדת עד כדי נקודה של ננומטרים ספורים בסריקות קוטר פני שטח של חומר אלקטרונים רגיש (להתנגד) גורם לשינוי כימי באזורים חשופים. לטון חיובי מתנגד כגון polymethylmethacrylate (PMMA), תוצאות חשיפת קרן אלקטרונים בפרדה של שרשרות פולימר ההלחנה להתנגד, שמוביל למסיסות גדלה בממס מתאים (מפתח). התהליך ליתוגרפיה אלומת האלקטרונים כולל ספין ציפוי של שכבה אחידה של להתנגד על מצע; חשיפה של החומר להתנגד הממוקד בתא ואקום עם אלומת אלקטרונים; ופיתוח של המדגם כדי להסיר את האזורים המסיסים.

יש לי תומך דיאלקטרי מתחת ננו המתכתי, כגון סיליקה התמזגה, been מוצג להגדיל באופן משמעותי את העוצמות בSERS בשל לוקליזציה של גלי plasmonic בהשוואה לחומרים אחרים כגון סיליקון ^14,15. עם זאת דפוסי EBL על מצעים דיאלקטרי, במיוחד בקנה המידה ננומטרי, כרוכים אתגרים משמעותיים בשל לחייב הצטברות במהלך חשיפה. בעבר, שהראינו ^16,17 שניתן להתגבר על קשיים אלה על ידי הצבת שכבות פולימר מוליך מעל להתנגד. איור 2 מראה סכמטי של תהליך הייצור הכולל באמצעות חשיפת EBL ופיתוח ואחריו בתצהיר מתכת והמראה לייצר ננו המתכתי על התמזגו תומך סיליקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. תכנית של דוארlectron יתוגרפיה קרן, בתצהיר מתכת, ותהליך שיגור הצעדים המועסקים לפברק ננו המתכתי על מצעים דיאלקטרי ^16-19. במאמר זה, אנו מציגים את כל הרצף של שלבי תהליך כרוכים בייצור מצעי SERS ידי EBL, ביו-functionalization של מצעים, ו אוסף של ספקטרום ראמאן. שלושה עיצובים חקרו בעבודות האחרונות שלנו ^18,19 מופנים (ראה איורים 3 ו -4, וטבלה 1). בעיצוב 1, חלבון רקומביננטי הוא משותק על ננו Au-פונקציונליות ביו על תמיכת סיליקה התמזגה (FS) ^18, וזיהוי SERS של החלבון בא לידי ביטוי. בעיצוב 2, רקומביננטי חלבון ^21,26,27 עם ובלי יגנד (D-גלוקוז) מחייב גלוקוז הוא משותק באמצעות תגי היסטידין ברווחים בין ננו Ag על FS מצופה ניקל, ואת הכריכה של גלוקוז לחלבון הוא זוהה. בעיצוב 3, thiolated DN מחייב דופמיןAptamer ^19,23 הוא משותק על ננו Au על FS, ואת הכריכה של דופאמין על ידי aptamer המשותק הוא הוכיח. כולל את כל שלבי הניסוי הרלוונטיים מהכנת מצע לרכישת ספקטרום ראמאן, ונציג של מולקולות ביולוגיות ואסטרטגיות של חוסר תנועה שונות, דוגמאות אלה הן שימושיות עבור מגוון רחב של יישומים, ממחקר חקר חקירת ממשקי ננו-ביולוגי על ידי SERS לפיתוח SERS חיישנים ביולוגיים של מולקולות קטנות המעסיקות חלבונים או aptamer ליגנד מחייב כשיטת הכרה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. ערכות של שלושה עיצובי נציג באמצעות מולקולות ביולוגיות שונות, שיטות של immobilization, ומצע חומרים: (א) חלבון משותק על ננו-הנקודות אצילי מתכת פונקציונליות על ידי monolayer עצמי התאספו (SAM) של חומצת 11-mercaptodecanoic (mua) במי DI; חלבון מתויג היסטידין גלוקוז המחייב (GBP) ומורכב עם D-גלוקוז משותק על פני המצע בין ננו-נקודות מתכת האצילות (B); -הופסק תיאול (C) aptamer דופמין מחייב השלים עם דופמין (DBA) משותק על ננו-נקודות אצילות מתכת. ראה פירוט נוסף בלוח 1. בעיצוב 2 מאויר על ידי פנל (B), מדגם ללא יגנד המקביל היה גם מוכן להשוואה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4.מולקולות ביולוגיות המועסקות בשלושה עיצובים: (א) חלבון; חלבון (B) גלוקוז מחייב וD-גלוקוז; (C) דופמין מחייב aptamer DNA ודופאמין. המבנים שלישוני החלבון ב( א) ו- (ב) נלקחים מבנק חלבון נתונים, PDB מזהה 1BDD ²⁰ ו2HPH ^21, בהתאמה, ונמשך עם VMD לLINUXAMD64, גרסת 1.9.1 ^22. המבנה משני aptamer ב( ג) הוא ניבא מהרצף ²³ באמצעות ValFold ²⁴ תוכנה ונמשך עם 3.0 PseudoViewer ^25. מכתבי G, A, T, C ומתאים לגואנין, אדנין, תימין, ציטוזין ונוקלאוטידים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

	עיצוב 1 </td>	עיצוב 2	עיצוב 3
Biopolymer	חלבון	חלבון קושר גלוקוז (GBP)	aptamer דופמין המחייב (DBA)
בינדר	חומצת 11-Mercaptoundecanoic (mua) monolayer עצמי התאספו (SAM)	תגי היסטידין	linkers תיאול
ליגנד	אף אחד	D-גלוקוז	דופמין
פתרון	Deionized מים (DI)	חיץ פוספט אשלגן	טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) וחומצת ethylenediaminetetraacetic חיץ (EDTA); נאגר מלוח פוספט (PBS)
מצע	מבני Au על FS	מבני Ag על FS מצופה ניקל	מבני Au על FS
ar בדוגמתea	4 מיקרומטר x 10 מיקרומטר	4 מיקרומטר x 8 מיקרומטר	4 מיקרומטר x 10 מיקרומטר
דפוס	נקודות Au, 50 ננומטר המגרש	נקודות Ag, 40 ננומטר המגרש	משושים Au, המגרש 200 ננומטר
		משושים Ag, המגרש 200 ננומטר	רפידות לא מובנים Au
		רפידות לא מובנים Ag
מינוני חשיפת EBL	נקודות:	נקודות: 105 μC / ² סנטימטר	משושים: 180 μC / ² סנטימטר
	מערכי 120 μC / ² סנטימטר	משושים: 170 μC / ² סנטימטר
	מערך השני 96 μC / ² סנטימטר
	מערך III 72μC / ² סנטימטר
גל עירור לייזר	532 nm	532 nm	780 nm

טבלת 1. שלושה פרויקטי מערכות ננו-ביולוגי.

Protocol

1. הכנת תשתית השתמש במסור מוליכים למחצה חיתוך לחתוך פרוסות סיליקה התמזגה (FS) לסנטימטר 1 × 1 סנטימטר או קוביות קטנות יותר. דגימות נקיות בתמיסת פיראניה (H 2 SO 4: H 2 O 2, 3: 1; זהירות: מחמצן חזק) אמבטיה 28 במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הקוביות במים ללא יונים ויבשים בחנקן. מניחים את הדגימות על פלטה חמה עם הפנים כלפי מעלה ב 180 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לקרר את הדגימות לאחר הסרת מהפלטה החשמלית לRT. לעיצובי 1 ו -3, המשך לשלב 2. לעיצוב 2, למקם את המדגם בתא אלומת אלקטרונים אידוי ומעיל עם שכבת 10 ננומטר של ניקל. 2. המצאה של מסכות PMMA בדוגמת Nano שימוש אלקטרונים Beam ליתוגרפיה (EBL) ספין מעיל PMMA להתנגד ושכבות מוליכות על מצעים. השתמש בטווית רקיק עם צ'אק ואקום ודגימות מקום בנפרד במרכז בצ'אק. מקום1 טיפה של polymethylmethacrylate (PMMA) להתנגד במרכז הדגימות באמצעות פיפטה זכוכית ספין על 3,500 סל"ד 60 שניות עם זמן רמפה 2 שניות. אופים את מצעים ב 180 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות. לאחר אפיית מצעים, לקרר את הדגימות לRT. עם מצעים מקוררים וחזרו לצ'אק הטווה, להפיץ ירידה של פולימר מוליך על פני המצע. ספין המצע במשך 40 שניות בסל"ד 3000 עם זמן רמפה 2 שניות. דגימות אופים בחום של 80 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. בצע חשיפת EBL לפי 16,17,18,29 הליך הסטנדרטי. שימוש בהוראות יצרן, להכין עיצוב חשיפת העסקת מינוני תכונה מטבלת 1 עם גודל צעד קרן הקטן ביותר האפשרי. טען את המדגם לתוך תא יתוגרפיה אלומת אלקטרונים. אם מערכת EBL אין autofocusing, להשתמש שריטה קטנה ממקום שבי התבנית היא להיחשף ומקצה חרוז לפוקוסing. שימוש בהוראות יצרן, לבצע את הנדרש תוך התמקדות ותיקון אסטיגמציה כמו גם יישור שדה כתיבה כמתאים, ולחשוף את המדגם. כדי לאפשר לפרופיל חשיפה ראוי ואיכות הדפוס הטובה ביותר, השתמש אנרגיית אלומת אלקטרונים 30 קאב ושל 7.5 מיקרומטר צמצם לחשיפות. הסר את פולימר המוליך ולפתח דגימות חשופות. הכן כוס עם מים ללא יונים (DI) להסרת פולימר המוליך וכוס שנייה בתערובת מפתח (IPA: H 2 O, 7: 3), ומערבבים במשך 5 דקות בRT. הכן isopropanol (טוהר גבוה) בכוס שלישית כסוכן שטיפה. בעזרת פינצטה, למקם את הדגימות למים במשך 3 שניות כדי להסיר את סרט פולימר המוליך, ואז למקם את המדגם ליזם ולהעביר את פינצטה לאט מעלה ומטה במשך 20 שניות. מייד להעביר את מצעים לisopropanol ולשטוף במשך 10 שניות יותר, לאחר מכן לייבש את המדגם עם חנקן. </ Ol> ייצור 3. המתכת האציל ננו טען את הדגימות במהופך למערכת מאייד אלומת האלקטרונים כדי לאפשר למתכת התאדתה להיות מופקד על הפנים הקדמיים של הדגימות. להפקיד רובד עבה Au 10 ננומטר על דוגמאות לעיצובי 1 ו -3, ושכבת 10 ננומטר עבה Ag לעיצוב 2 בשיעור של כ 0.1 nm / sec. מלא מערכת sonication לגובה המומלץ עם מים ולמלא כוס נפרדת עם אצטון. הנח פנים מדגם בחלק התחתון של הכוס ולאפשר המדגם לספוג במשך 10 דקות. מחזיק הכוס, למקם אותו לתוך אמבט המים ולאפשר לגובה של אצטון כדי להתאים את הגובה של המים ולהדליק את מערכת sonication. לאפשר sonication להתרחש עד 60 שניות. באותו האופן כפי שפורט בשלב 3.1, להכין מצעי משטח אחידים Au וAg על ידי תצהיר של 10 סרטי מתכת עבים ננומטר על FS (עיצובים 1 ו -3) וFS מצופה ניקל (עיצוב 2) substrates דילוג על שלב 2. 4. ביו-functionalization של מצעים הכן דגימות 1 עיצוב: הכן פתרון 1 מ"מ של 11 mercaptodecanoic-חומצה (mua) באתנול בRT. Sonicate במשך 10 דקות. לטבול את מצע nanostructured נכון בפתרון של mua במשך 48 שעות. יש לשטוף את המדגם עם אתנול שלוש פעמים ויבשות במשך 5 דקות בRT. הכן פתרון 75 מ"מ של N -ethyl- N '- carbodiimide (3 propyl (dimethylamino)) (EDC) במי DI. הכן פתרון 15 מ"מ של -hydroxysuccinimide N (NHS) במי DI. באמצעות הפקדת micropipette של NHS 100 μl על Au על המצע, ולהוסיף באופן מיידי של EDC 100 μl באותו האזור. דגירה דקות 1 כדי להפעיל את monolayer העצמי התאספו (SAM) של mua. מניחים ירידה של 100 μl של חלבון פתרון (47 מיקרומטר) על אותו האזור של המצע ולאחסן את המדגם עבור 24 שעות ב 5 מעלות צלזיוס בד פטרי רב-תאish עם 1 מיליליטר של מים די בתא אחר, ועם כיסוי אטום. יש לשטוף את המדגם במי DI 3 פעמים ברציפות על ידי ערבוב הדגימות בכוסות נפרדות במשך 20 שניות בכל כוס. אל תתנו הדגימות לייבש לאחר השטיפה או במהלך השטיפה. המשך לשלב 5. הכן 2 דוגמאות עיצוב: הכן פתרון 0.9 מ"מ חלבון קושר גלוקוז (GBP) של חיץ פוספט אשלגן (K 2 4 HPO, 25 מ"מ, pH 7.5). הכן פתרון 100 מ"מ של D-גלוקוז במאגר. מערבבים 30 μl של 100 פתרון D-גלוקוז מ"מ ו -30 μl של 0.9 מ"מ פתרון GBP באמצעות מיכל פלסטיק 1 מיליליטר microtube וmicropipette. דגירה למשך 30 דקות. הפקדה 20 μl של פתרון GBP ללא יגנד ושל פתרון GBP-מחויב ליגנד כל על מצעים מוכנים באמצעות micropipette. אחסן את הדגימות בשעה 5 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בצלחת פטרי עם מכסה אטום. יש לשטוף את הדגימות 3 פעמים בפתרון חיץ פוספט אשלגן ב RT. המשך לשלב 5. הכן עיצוב 3 דוגמאות: לדלל את פתרון דופמין מחייב aptamer (DBA) בריכוז של 1 מיקרומטר באמצעות חיץ טריס EDTA עם pH סופי של 7.4. הכן פתרון דופמין לריכוז 5 מיקרומטר על ידי מדידת אבקת דופמין על איזון אנליטיים ולערבב אותו שבנאגר מלוח פוספט (PBS) עם חרוז ומערבבים במשך 5 דקות. להפקיד ירידה של 20 μl של פתרון DBA על פני השטח של כל מצע ולתת הדגימות לשבת במשך השעה 1 בRT עם כיסוי על צלחת פטרי. יש לשטוף את הדגימות 3 פעמים בחיץ פוספט אשלגן (K 2 4 HPO, 25 מ"מ, pH 7.5). מניחים את הדגימות זקופים על גבי כיתה חדר נקי לנגב להתייבש הישבן תוך שמירת סרט בצד הקדמי של המצע. הגדר מדגם הצידה כביקורת. מניחים ירידה של 5 μl של o פתרון דופמיןn את פני השטח של הירידה הקיימת של פתרון חיץ PBS על הדגימות שנותרו עם ריכוזי דופמין הרצויים. דגירה המדגם עבור 10 דקות. מניחים ירידה של פתרון דופמין על פני השטח משטח Au ללא aptamer. דגירה של 10 דקות. יש לשטוף את הדגימות בפתרון חיץ פוספט אשלגן 3 פעמים. 5. ראמאן ספקטרוסקופיה מניחים כל דוגמא בתא אטומה למים, כדי למנוע אידוי על ידי חשיפת לייזר. ממלאי מזרק פלסטיק עם גריז אינרטי מבחינה כימית ואקום גבוה, דגימות מקום בשקופיות זכוכית ולוותר כמה מילימטרים של שומן המקיף את הדגימות בלי לגעת בדגימות. מניחים coverslip מיקרוסקופ על גבי מצעים ולחצו בעדינות כלפי מטה כדי ליצור חותם, יצירת ממשק נוזל דק שבין מצעים וcoverslips מבלי לאפשר החיץ לבוא במגע עם גריז הוואקום. שימוש במערכת מיקרוסקופ ראמאן אופטית, להשיג מיקוד על פני השטח של האזור בדוגמת ננו המתכת להיות נדגמו מבלי להדליק את הלייזר. לבצע דגימת ראמאן 18,19 עם עוצמת לייזר בין 2.4-3.1 mW עם משך זמן כולל של פחות מ -20 שניות כדי למנוע נזק למדגם עם מטרה של הגדלת 10X. לרכוש ספקטרום ראמאן עבור דגימות מעיצובים 1, 2, ו -3 באמצעות אורכי גל העירור כמצוין בטבלה 1. כמו כן לרכוש ספקטרום ראמאן שליטה לפתרונות של חלבון, GBP, ו- D-גלוקוז, ולאבקת דופמין העסקת שקופיות זכוכית ללא מתכת ננו כתומך להשוואה.

Representative Results

איסוף ספקטרום ראמאן שליטה למרכיבים העיקריים, כולל חלבונים חופשיים בפתרון וligands החופשי בפתרון או בצורת אבקה ללא שימוש במצעים המכיל מתכת, הוא חשוב כדי לאפשר השוואה נכונה, כמו גם למטרות פרשנות. איור 5 א 'מציג ראמאן טיפוסי ספקטרום לחלבון חופשי במי DI בשקופית זכוכית ללא מצעי nanostructured. שתי להקות בעוצמה הגבוהה ביותר ראמאן, הלהקה ב-1 סנטימטר 2931 וב1,091 -1 סנטימטר, מתאימות לתנודות מעורבות אג"ח CH וCS, בהתאמה. להקות אחרות בעוצמה ראמאן נמוכה יותר כגון 563 סנטימטר -1, 1,450 -1 סנטימטר, 1,653 -1 סנטימטר ו2,426 -1 סנטימטר, ניתן לייחס לסופרפוזיציה של מצבי רטט 18,32,33,34. ספקטרום ראמאן הבקרה לGPB החופשי יגנד בפתרון חיץ עם שלושה ריכוזים שונים, 0.3, 0.9 ו -1.3 מ"מ, מוצג באיור 5. בt הוא להבין, הפס הרחב סביב 3,400 -1 סנטימטר מתאים ל-35 הממס, ואילו הלהקה ב2,935 -1 סנטימטר מייצג תנודות מעורבות אג"ח CH של החלבון 32,33. איור 5 ג מראה את ספקטרום ראמאן הגבוה אורך גל לD-גלוקוז ב פתרון חיץ לריכוזים שונים: 1, 6, 100, 200, ו -400 מ"מ. כאשר הריכוז של גלוקוז הוא גדל, להקות רטט אג"ח CH להתעורר ב2,890 -1 סנטימטר ו2,960 -1 סנטימטר. ספקטרום ראמאן הבקרה של דופמין בצורת גביש שהושגה עם שני אורכי גל עירור 532 ננומטר ו780 ננומטר מוצג באיור 5D. הרבה של ספקטרום ראמאן מגיע מטבעת בנזן כיפוף ומתיחות קשר CH של המולקולה 19,36. חלק מהלהקות בסביבות 3,000 -1 סנטימטר הם נצפו רק בnm 532 אבל גל עירור לא 780 ננומטר. טען / 52,712 / 52712fig5.jpg "/> איור 5. ספקטרום ראמאן הבקרה של חלבון במי DI מתקבל ב532 ננומטר גל עירור 18 (א); ספקטרום ראמאן חלבון גלוקוז ללא יגנד המחייב של פתרון חיץ שהושג ב532 גל עירור ננומטר (B); ספקטרום ראמאן של D-גלוקוז בפתרון חיץ שהושג ב532 גל עירור ננומטר (ג); וספקטרום של אבקת דופמין שהושג באורכי גל 532 nm ו780 ננומטר עירור 19 (ד). כל הספקטרום הוא ספקטרום ראמאן רגיל של פתרונות (a, b, c) ואבקה (ד) על שקופיות זכוכית ללא מצעי nanostructured. ב( ד '), המשימה של משטרי משמרת ראמאן לתנודות מולקולריות שונות נעשתה באמצעות מערכת כללית האטומי ומולקולרי אלקטרוני מבנה (GAMESS) 30 וMacMolPlt 31 תוכנה כמפורט במקום אחר 19. פנל הודפס מחדש (א) באישור 18 Americחברת אבק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. על מנת לקבל ספקטרום SERS למולקולות ביולוגיות-משותק משטח, מצעים הכוללים ננו המתכתי על תומך סיליקה התמזגו מיוצרים כמתואר בשלבי 1-3. האיכות של מצעים מפוברקות מנוטרת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). נהלי SEM הסטנדרטי מתוארים במקום אחר 16,17,18, 19 ולא נכללו בפרוטוקול הנוכחי. איור 6 מציג תמונות נציג SEM של ננו-נקודות Au וAg וננו-משושה כמו (מודעת פנלים) מבנים, כמו גם שאינו רפידות -structured Au וAg (ה פנלים וf, בהתאמה). הצעדים הבאים כרוכים בחוסר תנועה של חומר ביולוגי על מצעים מובנים ננו העסקת שלושה עיצובים מפורטים בטבלה 1, ורכישה של ספקטרום SERS. בo בצו לשמור סביבה מימית במהלך ההדמיה ראמאן, כל דגימה ממוקמת בפתרון המקביל שלה (ראה טבלה 1), כתרים עם כיסוי זכוכית דק, ואטום כפי שמודגם באיור 7. מיקרוסקופ אלקטרונים 6. סריקת איור (SEM) תמונות של 10 ננומטר ננו העבה Au וAg המשטח מועסק כמצעי SERS: (A, B) מערכים של nanodots; (C, D) מערכים של ננו-משושים; (E, F) רפידות לא מובנים. מצעים עם מבני Au (משמאל) להעסיק תומך FS, ואילו מצעים עם מבני Ag (מימין) להשתמש ציפוי עבה ננומטר 10 Ni על FS. התמונות התקבלו כמתואר במקום אחר 16,17,18.pg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 7. תכנית של תא אטום למים להדמית ראמאן של דגימות פונקציונליות ביו בפתרון. בעיצוב 1, חלבון רקומביננטי הוא משותק על מצעים פונקציונליות על ידי monolayer התאספו עצמי של 11 mercaptodecanoic-חומצה (mua) במי DI 18. מצעים בעיצוב זה יורכבו משלושה מערכים של נקודות Au עם המגרש nm 50 ומרחקים בין-נקודה שונה על סיליקה התמזגה (ראה 6A דמויות ו -8). התהליך של חוסר תנועת חלבון מתחיל עם הקמתה של SAM על מצעים. כדי להשיג קשר הקוולנטי בין SAM והחלבון, קבוצות החומצה קרבוקסילית של טילי קרקע-האוויר הופכות לאמינה NHS-reactive אסתר על ידי טיפול בתערובת של N </em> -ethyl- N '- (3 propyl (dimethylamino)) carbodiimide (EDC) פתרון ופתרון -hydroxysuccinimide N (NHS) במי DI. חוסר תנועה של חלבון מתרחשת על ידי עקירה של קבוצת NHS על ידי שאריות ליזין החלבון 37. דוגמא של דגימות הדמיה לעיצוב 1 עם חלבון משותק על ננו Au מוצגת באיור 9. איור 9 א מציג תמונת מיקרוסקופ אופטית של הדגימות, אשר תורכבנה משלושה מערכים של nanodots Au-פונקציונליות ביו עם פערים בין-dot שונים (ראה גם איורים 3Aa ו -8), ואיור 9 מציג את מיפוי הרפאים ראמאן על מערכים אלה. ניתן לראות כי בעוצמות ראמאן הגבוהות ביותר נמצאות במערך שבו אני הפערים בין-dot הם צרים, ואילו עוצמות נמוכות יותר מתקבלות עבור מערך III עם הפערים בין-הנקודה הרחבה ביותר. זה יכול להיות מוסבר על ידי השפעת צימוד חזקה plasmon המיוצרת על ידי fie החשמלית גבוהה יותרLDS בחללים הצרים בין הנקודות 18. איור 9 ג מציג את ספקטרום SERS החזק ביותר מתקבל עבור מערכי I ו- II. הספקטרום להציג כמה להקות (1,630 -1 סנטימטר, 1,964 -1 סנטימטר, 2,280 -1 סנטימטר, 2,577 -1 סנטימטר, ו2,916 -1 סנטימטר) בסמוך למצבי ראמאן של חלבון חופשי בפתרון נראים באיור 5 א. המיוחס לתנודות של איגרות חוב שונים שנמצאו בחלבונים, הלהקות האלה גם מופיעות במקומות דומים בשני החלבון המשותק ובפתרון, או מעט עברו לwavenumbers הגבוה במעט כאשר משותק. בניגוד לכך, ספקטרום SERS של מצעי nanostructured דומים פונקציונליות על ידי mua SAM ללא החלבון להראות דפוס שונה לחלוטין 18, המאשר איור 9 שמייצג מיפוי SERS של א 'חלבון-משותק משטח אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 8. תמונות SEM של שלושה מערכים של nanodots Au על מצע FS משמשות בעיצוב 1 18. המערכים יש את אותו המגרש 50 ננומטר ומעט רדיוס נקודה שונה וכתוצאה ממידות רוחב שונה של פערים בין-נקודה. זו מושגת על ידי יישום מינוני חשיפת EBL שונים כדי לייצר מסכות PMMA לשלושה מערכים (ראה טבלה 1). מינוני חשיפה גבוהים יותר לגרום לחורים רחבים יותר במסכות PMMA, המאפשרים לגדלי נקודת Au גדולים יותר לאחר metallization והמראה. הודפס מחדש באישור מחברת אבק אמריקאי 18. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. les / ftp_upload / 52,712 / 52712fig9.jpg "/> הדמיה איור 9. SERS של חלבון-משותק מצע בעיצוב 1 18. תמונת מיקרוסקופ אופטית של המדגם (), הכולל שלושה מערכים של nanodots Au עם המגרש 50 ננומטר ופערים בין-נקודה שונות על מצע סיליקה התמזגה (ראה גם איור 6), כפי שמוצג באיור 3 א-פונקציונליות ביו. מיפוי ראמאן של המדגם (B). (C) SERS ספקטרום ממערך נקודת I ו- II. בפנל (B), הציר האנכי מייצג את המרחק על פני המצע, הציר האופקי מייצג את משמרת ראמאן, ובר האגדה מציין את עוצמות ראמאן. אנכי קווים מקווקווים בלוחות (B) ו- (ג) מייצג להקות ראמאן benchmark של חלבון חופשי בפתרון ו( *) בפנל (C) מציין להקות SERS ממערך I. ספקטרום ראמאן התקבל 532 ננומטר עירוראורך גל. הודפס מחדש באישור מחברת אבק אמריקאי 18. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. בעיצוב 2, חלבון רקומביננטי גלוקוז המחייב (GBP) 21 ומורכבים עם D-גלוקוז (ליגנד) הוא משותק על מצעים המתאימים בפתרון חיץ פוספט אשלגן. דוגמאות עם GBP ללא יגנד המשותק גם מוכנות להשוואה. בעיצוב הזה, חלבון קושר גלוקוז מחובר אל פני השטח באמצעות תג היסטידין, אשר נקשר גם לNi אבל לא למתכות אצילות 6. מאז מצעים מהווים מערכים של ננו-Ag נקודות, ננו-משושים, ורפידות Ag לא מובנים על FS מצופה ניקל (6B דמויות, 6D, ו6F, בהתאמה), אפשר לצפות ביותר של מולקולות חלבון משותקות להיות ממוקם בפערים בין Ag ננו בי ציפוי ניקל הוא available. ספקטרום ראמאן שהתקבל למשותק-גלוקוז חופשי וGBP-מחויב גלוקוז מוצג ב10A דמויות ו10B, בהתאמה. כל תערוכת הספקטרום אלה פס רחב בכ 3,300 -1 סנטימטר, אשר תואם את פתרון החיץ 35. הספקטרום שהושג עם כרית Ag לא מובנה מכיל רק להקה אחת זה ולא מראה שום מצבי רטט חלבון, המאשר כי חלבון משותק אינו נמצא על פני השטח Ag כצפוי. בניגוד לכך, הספקטרום שהושג עם מערכים של ננו-נקודות Ag ולהקות תערוכת ננו-משושים סביב 1,550 -1 סנטימטר ו2,900 -1 סנטימטר, המייצגים את אנליטי 32,33. בפרט, הפס הרחב סביב 1,550 -1 סנטימטר, הידוע בשם הלהקה אמיד השנייה, ניתן לייחסו לפפטיד תנודות אג"ח בחלבוני 33,34. במקרה נחשב, הלהקה הזו מייצגת סופרפוזיציה של מצבי הרטט מGBP משותקים על פני השטח Ni בין תכונת Agים, ומעיד על שיפור SERS של מצבים אלה בסביבה של ננו מתכת האציל כאשר מצעים המכילים ננו-נקודות או ננו-משושים משמשים. הלהקה הזו היא חלשה מאוד לחלבון בתמיסה בהיעדר שיפור SERS (איור 5) ונעדר ברפידות Ag ללא משטח Ni זמין לחלבון הקושר, אבל זה מבוטא היטב למצעי nanostructured עם כמה משטח Ni נגישים לחלבון להיקשר. עם זאת, חשוב עוד יותר למחקר הנוכחי הן להקות האחרות, צרות סביב כ -2,900 -1 סנטימטר שניתן לייחס לאג"ח CH wibrations 32,33. הספקטרום של GBP ללא סוכר בתערוכות להקה בולטת ב-1 סנטימטר 2933 עם מצע ננו-נקודות, ולהקה חלשה אך ניתן להבחין באורך גל דומה עם מצע ננו-המשושים (איור 10 א). להבדיל מהמקרה של חלבון חופשי גלוקוז, ספקטרום SERS של GBP-מחויב גלוקוז מוצג בFigu מחדש תערוכת 10B שתי להקות המתאימות CH משטרי תנודות אג"ח, ב2,850 -1 סנטימטר ו2,910 -1 סנטימטר. הלהקות בולטות גם בספקטרום של GBP-מחויב גלוקוז במצע ננו-משושים, והם גם שניתן לראות בספקטרום של GBP על מצע ננו-נקודות. הלהקה ב2,850 -1 סנטימטר היא קרובה סביר ל2,890 -1 סנטימטר אחד בספקטרום ראמאן השליטה מD-גלוקוז בתמיסה, ולכן ניתן לייחס לגלוקוז קשור לחלבון, ואילו להקה אחרת (ב2,910 סנטימטר -1) ניתן לייחסו לתנודות אג"ח CH של שני החלבונים וגלוקוז. ניתן להסיק כי הבדל של חתימות SERS מGBP-משותק מצע כבול-גלוקוז-גלוקוז חופשי וניתן לצפות באזור זה, ותנודות אג"ח CH של גלוקוז-מחויב הן לגילוי חלבון המעסיק את העיצוב שתואר. 10.jpg "/> ספקטרום 10. SERS דמותו של ליגנד חופשי () וחלבון קשור ליגנד (B) מחייב גלוקוז המשותק בשלושה מצעים שונים בעיצוב 2. הספקטרום התקבל עם גל עירור 780 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה. בעיצוב 3, aptamer דופמין המותאם אישית מחייב (DBA) עם סיום תיאול 23 הוא משותק על המצע בטריס פתרון חיץ (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), ודופמין אז חייב aptamer המשותק 19. מצעים לעיצוב הזה מכילים מערכים של ננו-משושים Au על FS (איור 6 ג). רפידות Au לא מובנים (איור 6-ה) משמשות גם למטרות בקרה. מאז ה- DNA הוא במהות ניאון 38, waveleng עירור 780 ננומטר ה משמשת בעיצוב 3 להפחית גורם זה. בעיצוב זה, אלמנט ההכרה (aptamer) אינו ראמאן פעיל באזור של משמרות ראמאן נחשבות באיור 11, ואילו דופמין תערוכות פעילות ראמאן משמעותי באזור זה. מאז אות מהדגימות נחשפו לדופמין בלבד ללא aptamer המשותק לא מראה להקות דופמין תוצאה 19, להקות SERS נצפו צפויות לנבוע מדופמין קשור aptamer. איור 11 משווה את ספקטרום SERS של aptamer משותק על ננו זהב לפני ואחרי התוספת של דופמין. כצפוי, aptamer ללא דופמין המשותק אינו תערוכת להקות ראמאן. בניגוד לכך, מספר להקות ראמאן הבולט שנצפה aptamer המשותק בכריכת דופמין. העמדות של רוב הלהקות באיור 11 קרובות לאלה בדופמין גבישים, אם כי בהבדלים באמפליטודות. igure 11 "src =" / קבצים / ftp_upload / 52,712 / 52712fig11.jpg "/> ספקטרום 11. SERS איור של נטול יגנד (קו סגול) ונכנס ליגנד (קו כחול) aptamer משותק על מצעי ננו-המשושה Au בעיצוב הכריכה-דופמין 3 19. הקו האדום מראה ספקטרום SERS שליטה של אבקת דופמין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

SERS צובר הכרה כטכניקה בעלת עוצמה אדירה של ביו-זיהוי המציעה יתרונות ייחודיים רבים. הקשר עם תנודות מולקולריות מאפשר זיהוי באופן סלקטיבי "טביעות אצבע" של analytes הספציפי מספקטרום SERS, ואילו הרגישות הגבוהה במיוחד מאפשרת איתור כמויות קטנות מאוד של אנליטי ^9,10,11,35. יתר על כן, SERS הוא טכניקה הורסות שהוא גם רגיש יחסית למים, ובכך שהוא מתאים היטב לחיטוט חומרים ביולוגיים בסביבה המימית הטבעית שלהם ^9. התוצאות שהוצגו להדגיש יתרונות אלה, כמו גם נוספים להפגין פוטנציאל חזק של SERS כטכניקה ללא תווית מאוד גמישה ביו-זיהוי. בשלושת עיצובי העסקת monolayers של מולקולות ביולוגיות-משותק מצע שונים, מצבי ראמאן כבר זיהו כי ניתן לייחס בביטחון לanalytes המסוים. כי זיהוי של מולקולות ביולוגיות אלה, or ligands שלהם, כבר הוכיח העסקת משטחים מישוריים של סיליקה התמזגה כתמיכה במצעי SERS, הופך את העיצובים תואמים עם אלקטרוניקה נוכחית והגדרות מיקרופלואידיקה, מבטיח יישומים רבים ביחס עם ארכיטקטורות המתעוררים ביו-אלקטרוני ממשק חומרים ביולוגיים עם משטחים של אלקטרוני והתקני אלקטרו-כימיים ^2,3. חשוב לציין, בשתיים משלושה עיצובי זיהוי SERS הודגם עבור מחייב ספציפי של מולקולות קטנות, כגון גלוקוז ודופמין, המעסיק monolayers של החלבון-משותק פני השטח וaptamer, בהתאמה, כאלמנטי הכרה.

עם זאת, יש לקחת כמה היבטי טיפול של על מנת להשיג ביו-זיהוי SERS יעיל בהגדרה "על השבב". קודם כל, אתגר ידוע שהוא משותף לרוב המולקולות ביולוגיות הוא הנטייה שלהם כדי לבזות, במיוחד כאשר הם נחשפים לתנאים שאינם טבעיים כגון envi היבשronment או אור הלייזר אינטנסיבי. לאורך כל הפרוטוקול, שהדגשנו את החשיבות של שמירה על הדגימות תמיד פונקציונליות ביו השקוע בפתרונות מתאימים במהלך הניסוי כולו, מהכנת הדגימות לרכישת ספקטרום ראמאן. באפשרות השנייה, תא אטום למים מותאמים אישית תוכנן (איור 7), כדי למנוע אידוי של הנוזל במהלך חשיפות לייזר. גם משך החשיפה ועוצמת לייזר צריך להיות מוגבל כמתואר בשלב 5.3 של הפרוטוקול, כדי למנוע נזק של הדגימות.

התוצאות של זיהוי SERS נמצאות רגישות לגיאומטריה של המצע המועסק, ובמיוחד את ההפרדה בין התכונה של ננו המתכתי. כפי שעולה מנתוני 8 ו -9, עוצמת SERS של דגימות 1 עיצוב תלוי במידה רבה ברוחב של הפערים בין ננו-נקודות Au על סיליקה התמזגה. מתוך שלושה מערכים של nanodots Au נבדקו in עיצוב זה (איור 8), עוצמת ראמאן הגבוהה ביותר שהושג עם מערכי, שבו יש פערים הצרים בין תכונות Au ולכן הוא מספק שיפור שדה האלקטרומגנטי יעיל יותר. כאיור 9 ממחיש, נדרשת שליטה בהפרדות בין-תכונה ברמה של 10-20 ננומטר או פחות. העסקת EBL עבור בודה מצעי SERS, כפי שהודגם כאן, מספק רזולוציה יעילה במיוחד לשליטה ברוחב של פערים בין-תכונה. עם EBL חיובי טון להתנגד כגון PMMA, בגודל של חורים במסכות PMMA יכול להיות מגוון, פשוט על ידי שינוי מינון החשיפה. לאחר המראה זה תוצאות בגדלים שונים של נקודות מתכת מפוברקות, והרוחב של פערים בין הנקודות עשוי להיות מכוון כרצוי על ידי בחירת חשיפת EBL נכונה מינוני ^18.

האתגר השני הוא אופטימיזציה של גיאומטריה מצע SERS ליישום ביו-זיהוי ספציפי. למרות שאני השפעת השיפורncreases עם ירידה של הפערים בין-התכונה, הגודל גדול יחסית של מולקולות ביולוגיות מטיל מגבלות על אופן צר הפערים יכולים להיות. הדבר ניכר מן התוצאות עבור עיצוב 2, שבו שיטת הקיבוע היא כזה שהחלבון ביעילות נקשר רק על פני השטח בין נקודות מתכת אצילות, אך לא לעצמם נקודות (ראה איור 3). כפי שעולה מתרשים 10, ספקטרום SERS לרפידות Ag לא מובנים לא מראה שום להקות מאנליטי. למרות הרפידות להציג מבנה ננו-גבישים עם פערים בין-אי דקים מאוד (ראה איור 6F) פערים אלה הם צרים מלהכיל את מולקולת חלבון. עם זאת, ממד נוסף של מורכבות מתווסף כאשר יש חלבון ליגנד המחייב כדי להתגלות. באיור 10, להקות SERS CH הן בולטות יותר בספקטרום מGBP-מחויב ליגנד מאשר באחד ללא יגנד, אשר עשויים להיות מוסבר באופן היפותטי על ידי שינוי בקונפורמציה GBPעל כריכה של D-גלוקוז ^{2 7,27,} וכתוצאה מכך מבנה נוקשה יותר עם פעילות ראמאן מוגברת. אם משווה את שני מצעי nanostructured, להקת CH מחלבון ללא יגנד הוא חזק יותר בספקטרום SERS שהושג עם מצע ננו-נקודות, ואילו שתי להקות החלבון וCH הגלוקוז מהחלבון קשור ליגנד הן בולטות יותר עם ננו-המשושים מצע. שני גורמים צפויים לגרום להבדלים אלה, על זמינותו של מרחב שבין Ag תכונות שבו GBP יכול להיקשר לNi, ואת הרגישות של החלבון-מחויב ליגנד ויגנד חופשי לשיפור האלקטרומגנטי של פיזור ראמאן ב" נקודות חמות " בין תכונות אלה. מצד אחד, דפוס ננו-נקודות מציע אזור בין-תכונה גדולה יחסית שבו ציפוי ניקל זמין לחלבון להיקשר, מה שעשוי להסביר להקת CH בולטת יותר נצפתה עבור GBP ללא גלוקוז במצע ננו-נקודות Ag. מצד השני, בשל struc לא האחיד שלהם ture (ראה איור 6 ד), ננו-משושים Ag יכול להיות נוטים להראות שיפור אלקטרומגנטית חזק יותר בפערים צרים בין איי Ag בתוך ננו-משושים וכתוצאה מלהקות רטט CH חזקות מGBP-מחויב גלוקוז במצע ננו-המשושים. פרטי חלק ממשחק גומלין זה דורשים אימות נוספת, ואופטימיזציה של מצעי SERS לanalytes המורכב של חלבונים גדולים כמו GBP עדיין בצנרת.

ברור, זיהוי SERS של יגנד מחייב העסקת מולקולות הביולוגיות משותקות כאלמנט הכרה הוא הקל כאשר רק יגנד הוא ראמאן הפעיל באזור שנבחר, ואילו הרכיבים האחרים אינם. זהו המקרה של 3 עיצוב, שבו להקות SERS הבולט של דופמין קשור aptamer מתקבלות (איור 11). זוג aptamer-דופמין מציג סגוליות מצוינת וספקטרום SERS כולל להקות בולטות ללא כל אות רקע משמעותית.

<p class="jove_content"> מראש עתיד של טכנולוגית SERS תווית-תשלום יהיה כרוך בבדיקות נרחבות של שיפור אות SERS 'המולקולות הביולוגיות עם מגוון רחב של עיצובי ננו-מבנה פני השטח שונים. השימוש ביתוגרפיה אלומת אלקטרונים ישיר לכתוב לפברק ננו השונים עם רמה מעולה של שליטה על גודל, צורה, והפרדה בין תכונה, בשילוב עם מדגם פרוטוקולי ההכנה שהוצגו כאן, יאפשר להשיג השוואה ואימות צולבת של התוצאות על ידי קבוצות מחקר שונות. זה היה מענה לאתגר הגדול של שחזור כאשר מצעי SERS מיוצרים ההעסקה חלופית "מלמטה למעלה" שיטות ^11,12,13, המאפשר לשליטה טובה יותר בגודל של ננו-מבנה המתכת ועמדה כלפי זיהוי אמין של עיצוב מצע אופטימלי למגוון רחב של יישומים. יכולת הרחבה של טכניקות אלה יכול לאחר מכן ניתן לשפר על ידי שילוב של EBL עם שיטות nanolithography משלים כגון ננוליתוגרפיה חותם ¹⁹ לכיוון ייצור המוני עתיד של עיצובים בקנה מידה ננומטרי אופטימיזציה שימוש בטכניקות EBL מתכונן.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside, and Albert Cao for their help in developing and preparing the protein conjugates as well as the DNA aptamer; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar, and Trevor Olsen for their assistance in the sample preparation, Jonathan Mane for his assistance in generating images of the molecular structures; and the funding sources including the National Research Council of Canada – National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), and the University of Alberta for supporting the work.

Materials

11-Mercaptoundecanoic acid (MUA)	Sigma Aldrich (www.sigmaalrich.com)	450561 ALDRICH	Used for surface functionalization in Design 1
Conductive polymer	Mitsubishi Rayon (www.mrc.co.jp)	aquaSAVE-57xs	A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures
D-glucose	Collaborator Lab.		Ligand in Design 2
Dopamine	Collaborator Lab.		Ligand in Design 3
Dopamine binding aptamer (DBA)	Integrated DNA Technologies Inc. (www.idtdna.com)	5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'	Biopolymer in Design 3
Fused silica wafers	Mark Optics www.markoptics.com
Glucose binding protein (GBP)	Collaborator Lab. (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi\|145579532)	PDB ID 2HPH	Biopolymer in Design 2
High vacuum grease	Dow Corning (www.dowcorning.com)		Used to seal water-proof chamber, step 5.1
Hydrogen Peroxide 30%, H₂O₂	J.T. Baker		Used for pirahna solution, step 1.2
N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC)	Sigma Aldrich www.sigmaaldrich.com	03450 FLUKA	Used for immobilization of biopolymer in Design 1
N-Hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	130672 ALDRICH	Used for immobilization of biopolymer in Design 1
Potassium phosphate buffer	Collaborator Lab.		Buffer used in Raman sampling
Phosphate buffered	Collaborator Lab.		Solvent in Design 3
saline (PBS)
Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2	MicroChem (www.microchem.com)		A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist
Recombinant protein A	Protein Mods Inc (www.proteinmods.com)	PDB ID 1BDD (www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd)	Biopolymer in Design 1
Sulfuric acid 96%, H₂SO₄	J.T. Baker		Used for pirahna solution, step 1.2
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer	Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	T9285 SIGMA	Buffer in Design 3
Dicing saw	Diamond Touch Technology Inc.		Used to cut FS wafer, step 1.1
	(17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO)
Electron beam evaporator	Kurt J. Lesker (www.lesker.com)		Used for Au and Ag evaporation
Electron beam evaporator	Johnsen Ultravac (JUV) (www.ultrahivac.com)	JuV E-gun	Used for Ni evaporation
Microscope cover slips (25 mm)	Fisher Scientific (www.fishersci.ca)	12-545-102	Used in water-proof chamber, step 5.1
Microscope slides (3×1 in.)	Fisher Scientific (www.fishersci.ca)		Used in water-proof chamber, step 5.1
Raith 150^TWO EBL exposure system	Raith Inc. (www.raith.com)	Raith 150^TWO system	Used for EBL exposures, step 2.2
Raman microscope	Thermo Scientific (www.thermoscientific.com)	Nicolet Almega XR	Used for Raman spectroscopy, step 5.3
Sonicator system	Branson (www.bransonic.com)		Used for liftoff and solutions mixing
Spinner	Brewer Spinner and Hotplate (www.brewerscience.com)	Cee 200X and Cee 1300X	Used to spin-coat PMMA and conductive polymer, step 2.1

References

Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medlintz, I. L. Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques. Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).
Walcarius, A., Minteer, S. h. D., Wang, J., Yu, L., Merkoçi, A. Nanomaterials for Bio-Functionalized Electrodes: Recent Trends. J. Mater. Chem. B. 1, 4878-4908 (2013).
Kim, J., et al. Applications, Techniques, and Microfluidic Interfacing for Nanoscale Biosensing. Microfluid. Nanofluid. 7, 149-167 (2009).
Rassaei, L., Singh, P. S., Lemay, S. G. Lithography-Based Nanoelectrochemistry. Anal. Chem. 83, 3974-3980 (2011).
Wong, L. S., Khan, F., Micklefield, J. Selective Covalent Protein Immobilization: Strategies and Applications. Chem. Rev. 109, 4025-4053 (2009).
Ley, C., Holtmann, D., Mangold, K. -. M., Schrader, J. Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Electrodes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 88, 539-551 (2011).
Kim, D., Herr, A. E. Protein Immobilization Techniques for Microfluidic Assays. Biomicrofluidics. 7, 041501 (2013).
Anker, J. N., Hall, W. P., Lyandres, O., Shah, N. C., Xhao, J., Van Duyne, R. P. Biosensing with Plasmonic Nanosensors. Nature Materials. 7, 442-453 (2008).
Bantz, K. C., et al. Recent Progress in SERS Biosensing. Phys.Chem. 13, 11551-11567 (2011).
Sharma, B., Frontiera, R. R., Henry, A. -. I., Ringe, E., Van Duyne, R. P. SERS: Materials, Applications, and the Future. Mater. Today. 15, 16-25 (2012).
Kleinman, S. L., Frontiera, R. R., Henry, A. -. I., Dieringer, J. A., Van Duyne, R. P. Creating, Characterizing, and Controlling Chemistry with SERS Hot Spots. Phys.Chem.Chem.Phys. 15, 21-36 (2013).
Fan, M., Andrade, F. S., Brolo, A. G. A Review on the Fabrication of Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy and their Applications in Analytical Chemistry. Anal. Chim. Acta. 693, 7-25 (2011).
Cao, Y., Li, D., Jiang, F., Yang, Y., Zh, H. Engineering Metal Nanostructure for SERS Application. J. Nanomater. 123812, 1-12 (2013).
Glembocki, O., Rendell, R., Alexson, D., Prokes, S., Fu, A., Mastro, M. Dielectric-Substrate-Induced Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. B. 80, 085416 (2009).
Merlen, A., et al. Surface Enhanced Spectroscopy with Gold Nanostructures on Silicon and Glass Substrates. Surf. Sci. 605, 1214-1218 (2011).
Muhammad, M., Buswell, S. C., Dew, S. K., Stepanova, M. Nanopatterning of PMMA on Insulating Surfaces with Various Anticharging Schemes Using 30 keV Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 29, 06F304 (2011).
Peters, R., Fito, T., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Study of Multilayer Systems in Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 31, 06F407 (2013).
Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Application of EBL Fabricated Nanostrucutred Substrates for SERS Detection of Protein A in Aqueous Solution. J. Vac. Sci. Technol.B. 31, (2013).
Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Protein-Ligand Binding Using D-glucose and Glucose Binding Protein on Nanostructured Plasmonic Substrates. , (2014).
Peters, R. . Fabrication and Testing of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for the Detection of Biomolecules [MSc Thesis]. , (2014).
Gouda, H., Torigoe, H., Saito, A., Sato, M., Arata, Y., Shimada, I. Three-Dmensional Solution Structure of the B Domain of Staphylococcal Protein A: Comparisons of the Solution and Crystal Structures. Biochemistry. 31, 9665-9672 (1992).
Cuneo, M. J., Johnson, S. J., Beese, L. S., Hellinga, H. W. High Resolution Structure of E. Coli Glucose/Galactose Binding Protein Bound with Glucose. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank. , (2009).
Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD – Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics. 14, 33-38 (1996).
Walsh, R., DeRosa, M. C. Retention of Function in the DNA Homolog of the RNA Dopamine Aptamer. Biochem. Biophys. Res. Comm. 388, 732-735 (2009).
Akitomi, J., Kato, S., Yoshida, Y., Horii, K., Furuich, M., Waga, I. ValFold: Program for the Aptamer Truncation Process. Biomed. Inf. 7, 38-40 (2011).
Han, K., Lee, Y., Kim, W. PseudoViewer: Automatic Visualization of RNA Pseudoknots. Bioinformatics. 18, S321-S327 (2002).
Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic Binding Proteins: a Versatile Superfamily for Protein Engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 495-504 (2004).
Benson, D. E., Conrad, D. W. Design of Bioelectronic Interfaces by Exploiting Hinge-Bending Motions in Proteins. Science. 293, 1641-1644 (2001).
Bozic, S., Chorzempa, J. . Pirahna Cleaning. , (2011).
Mohammad, M. A. Raith 150TWO SOP. , (2011).
Schmidt, M. W., et al. General Atomic and Molecular Electronic Structure System. J. Comput. Chem. 14, 1347-1363 (1993).
Bode, B. M., Gordon, M. S. MacMolPlt: a Graphical User Interface for GAMESS. J. of Mol. Graph. Mod. 16, 133-138 (1998).
Bright, A., Devi, T. S. R., Gunasekaran, S. Spectroscopical Vibrational Band Assignment and Qualitative Analysis of Biomedical Compounds with Cardiovascular Activity. Int. J. Chem. Tech. Res. 2, 379-388 (2010).
Bandekar, J. Amide Modes and Protein Conformation. Biochim. Biophys. Acta. 1120, 123-243 (1992).
Barth, A., Zscherp, C. What Vibrations Tell About Proteins. Quarterly Reviews of Biophysics. 35, 369-340 (2002).
Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K. h., Stoddart, P. R. M. i. t. c. h. e. l. l. A., Kalantar-Zadeh, K. Microfluidics and Raman Microscopy: Current Applications and Future Challenges. Chem. Soc. Rev. 42, 5880-5906 (2013).
Park, S. -. K., Lee, N. -. S., Lee, S. -. H. Vibrational Analysis of Dopamine Neutral Base based on Density Functional Force Field. Bull.-Korean Chem. Soc. 21, 959-968 (2000).
Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors. Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).
Lakowicz, L. R., et al. Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer. Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Peters, R. F., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates. J. Vis. Exp. (97), e52712, doi:10.3791/52712 (2015).

Automatically Generated