Surface Enhanced Raman Spectroscopy detección de biomoléculas mediante EBL Fabricados Nanoestructurados Sustratos

Recogida de control de espectros Raman para los componentes principales, incluyendo las proteínas libres en solución y ligandos libres en solución o en forma de polvo sin usar sustratos que contienen metal, es importante para permitir una comparación adecuada, así como para fines de interpretación. Figura 5A presenta una Raman típico espectro para proteína libre A en agua DI en un portaobjetos de vidrio sin sustratos nanoestructurados. Dos bandas con la mayor intensidad de Raman, la banda en 2931 cm -1 ya 1091 cm -1, corresponden a vibraciones que implican enlaces CH y CS, respectivamente. Otras bandas con menor intensidad Raman como 563 cm -1, 1450 cm -1, 1653 cm -1 y 2426 cm -1, se puede atribuir a una superposición de modos de vibración 18,32,33,34. Espectros Raman de control para el GPB ligando libre en solución tampón con tres concentraciones diferentes, 0,3, 0,9 y 1,3 mm, se muestran en la Figura 5B. En t él figura, la banda ancha alrededor de 3.400 cm-1 corresponde al disolvente 35, mientras que la banda en 2935 cm -1 representa las vibraciones que implican enlaces CH de la proteína 32,33. Figura 5C muestra la alta longitud de onda del espectro Raman para D-glucosa en solución tampón para diferentes concentraciones: 1, 6, 100, 200 y 400 mM. Cuando se aumenta la concentración de glucosa, bandas de enlaces CH vibración surgen a 2890 cm -1 y 2960 cm -1. Control de espectros Raman de dopamina en forma de cristal obtenido con ambas 532 nm y 780 nm longitudes de onda de excitación se muestra en la Figura 5D. Gran parte del espectro Raman viene del anillo de benceno de flexión y tramos CH de enlace de la molécula 19,36. Algunas de las bandas en torno a 3000 cm-1 sólo se observan en el 532 nm pero no 780 nm de excitación de longitud de onda. pload / 52712 / 52712fig5.jpg "/> Figura 5. Control espectro Raman de la proteína A en agua DI obtenerse a 532 nm de longitud de onda de excitación 18 (A); Espectros Raman de proteína de unión a glucosa-ligando libre en solución tampón obtenerse a 532 nm de longitud de onda de excitación (B); Espectros Raman de D-glucosa en la solución tampón obtenerse a 532 nm de longitud de onda de excitación (C); y los espectros de polvo de dopamina obtuvo a 532 nm y 780 nm longitudes de onda de excitación 19 (d). Todos los espectros son espectros de Raman regular de soluciones (a, b, c) y polvo de (d) en portaobjetos de vidrio sin sustratos nanoestructurados. En (D), la asignación de Raman regímenes de turnos a diferentes vibraciones moleculares se realizó utilizando general Atómica y Molecular Electronic System Estructura (GAMESS) 30 y el software MacMolPlt 31 como se detalla en otro lugar 19. Panel Reproducido (a) con permiso de 18 Americuna Sociedad de vacío. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. A fin de obtener espectros SERS para biomoléculas inmovilizada en la superficie, los sustratos que comprenden nanoestructuras metálicas sobre soportes de sílice fundida se fabrican como se describe en los pasos 1-3. La calidad de sustratos fabricados se controla mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Los procedimientos estándar SEM se describen en otro 16,17,18, 19 y no se incluyen en el presente protocolo. La figura 6 muestra imágenes SEM representativas de Au y Ag nano-puntos y nano-hexágono como estructuras (paneles ad), así como la no -structured Au y Ag almohadillas (paneles E y F, respectivamente). Los próximos pasos implican la inmovilización de material biológico sobre los sustratos nanoestructurados que emplean tres diseños enumerados en la Tabla 1, y la adquisición de sus espectros SERS. En o rder para mantener un entorno acuoso durante la exploración Raman, cada muestra se coloca en su solución correspondiente (véase la Tabla 1), tapado con una cubierta de vidrio delgado, y sellado como se ilustra en la Figura 7. Figura 6. microscopio electrónico de barrido (SEM) imágenes de nanoestructuras 10 nm de espesor Au y Ag de superficie utilizados como sustratos SERS: (A, B) matrices de nanopuntos; (C, D) matrices de nano-hexágonos; (E, F) almohadillas no estructurados. Sustratos con Au estructuras (izquierda) emplean soportes FS, mientras que los sustratos con estructuras Ag (derecha) utilizan una capa de Ni nm de espesor 10 en el FS. Las imágenes se obtuvieron como se describe en otro lugar 16,17,18.pg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7. Esquema de la cámara a prueba de agua para Raman de imágenes de muestras bio-funcionalizado en solución. En Diseño 1, proteína recombinante A se inmoviliza sobre los sustratos funcionalizados por una capa monomolecular auto-ensamblada de 11-mercaptodecanoic ácido (MUA) en agua DI 18. Los sustratos en este diseño comprenden tres conjuntos de puntos de Au con un paso de 50 nm y diferentes distancias inter-punto en sílice fundida (véase Figuras 6A y 8). El proceso de la inmovilización de proteínas se inicia con la formación de una SAM sobre los sustratos. Para obtener la unión entre el SAM y la proteína covalente, los grupos ácido carboxílico de SAMs se transforman en amina reactiva-éster de NHS mediante tratamiento con una mezcla de N </em>-etil-N '- (3- (dimetilamino) propil) carbodiimida (EDC) N hidroxisuccinimida (NHS) en agua DI y solución. Inmovilización de la proteína A se produce por el desplazamiento del grupo NHS por residuos de lisina de la proteína 37. Un ejemplo de muestras de imagen para el diseño 1 con proteína A inmovilizada sobre Au nanoestructuras se muestra en la Figura 9. Figura 9A presenta una imagen de microscopía óptica de las muestras, que comprenden tres conjuntos de bio-funcionalizado Au nanopuntos con diferentes espacios entre puntos (véase también las figuras 3Aa y 8), y la Figura 9B muestra la asignación espectral Raman sobre estas matrices. Se puede observar que las mayores intensidades Raman se encuentran para Array I en la que los espacios entre puntos son los más estrechos, mientras que las intensidades más bajas se obtienen para Array III con mayores diferencias inter-punto. Esto puede explicarse por un efecto de acoplamiento de plasmón más fuerte producido por el aumento de fie eléctricalds en los estrechos espacios entre los puntos 18. Figura 9C muestra los espectros SERS más fuerte obtenida para matrices I y II. Los espectros muestran varias bandas (1630 cm -1, 1964 cm -1, 2280 cm -1, 2577 cm -1 y 2916 cm -1) en la proximidad de los modos Raman de proteína libre en una solución visto en la figura 5A. Atribuible a vibraciones de diversos enlaces que se encuentran en las proteínas, estas bandas o bien aparecen en lugares similares en ambos proteína inmovilizada y en solución, o se desplazan ligeramente hacia números de onda un poco más altos cuando se inmoviliza. Por el contrario, los espectros SERS de sustratos nanoestructurados similares funcionalizado por MUA SAM sin ​​la proteína muestran un patrón completamente diferente 18, lo que confirma que la Figura 9 representa la cartografía SERS de inmovilizado superficie de la proteína A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra. Figura 8. Imágenes SEM de tres matrices de Au nanopuntos sobre sustrato FS utilizados en el diseño 1 18. Las matrices tienen el mismo paso 50 nm y ligeramente diferentes radios de punto que resulta en diferentes anchuras de espacios entre puntos. Esto se logra mediante la aplicación de diferentes dosis de exposición EBL para producir máscaras de PMMA para las tres matrices (véase la Tabla 1). Dosis de exposición más altos producen agujeros más anchos en las máscaras de PMMA, lo que permite mayores tamaños de punto Au después de la metalización y el despegue. Reproducido con permiso del 18 Sociedad Americana de vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. les / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg "/> Figura 9. SERS de formación de imágenes de sustrato-proteína A inmovilizada en Diseño 1 18. (A) imagen de microscopio óptico de la muestra, que comprende tres conjuntos de Au nanopuntos con paso 50 nm y diferentes espacios entre puntos sobre un sustrato de sílice fundida (véase también la Figura 6), bio-funcionalizado como se muestra en la Figura 3A. (B) de mapeo Raman de la muestra. (C) SERS espectros de matriz de puntos I y II. En el panel (B), el eje vertical representa la distancia a través del sustrato, el eje horizontal representa el desplazamiento Raman, y la barra de leyenda indica las intensidades Raman. Vertical líneas discontinuas en los paneles (B) y (C) representan bandas Raman de referencia de proteína libre en una solución y (*) en el panel (C) indica bandas SERS de matriz I. El espectros Raman se obtuvieron 532 nm de excitaciónlongitud de onda. Reproducido con permiso del 18 Sociedad Americana de vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. En Diseño 2, la proteína recombinante de unión a glucosa (GBP) 21 complejado con D-glucosa (ligando) se inmoviliza sobre los sustratos apropiados en solución tampón de fosfato de potasio. Las muestras con inmovilizada GBP-ligando libre también se preparan para la comparación. En este diseño, la proteína de unión de glucosa se ​​une a la superficie por medio de una etiqueta de histidina, que se une así a Ni, pero no a los metales nobles 6. Desde los sustratos comprenden matrices de Ag nano-puntos, nano-hexágonos y almohadillas Ag no estructurados en FS con recubrimiento de Ni (Figuras 6B, 6D y 6F, respectivamente), uno puede esperar que la mayoría de las moléculas de proteínas inmovilizadas que se ubicará en las brechas entre Ag nanoestructuras donde recubrimiento de Ni es available. El espectros Raman obtenido para inmovilizada libre de glucosa y glucosa unida a GBP se muestra en las Figuras 10A y 10B, respectivamente. Todos estos exhiben espectros de una amplia banda a aproximadamente 3.300 cm -1, que corresponde a la solución tampón 35. Los espectros obtenidos con una almohadilla Ag no estructurada contiene sólo que esta banda única y no muestran ningún modos de vibración de proteína, lo que confirma que la proteína inmovilizada no se encuentra en la superficie de Ag como se esperaba. Por el contrario, los espectros obtenidos con matrices de Ag nano-puntos y bandas de exhibición nano-hexágonos alrededor de 1550 cm -1 y 2900 cm -1, que representan el 32,33 analito. En particular, la banda ancha alrededor de 1550 cm -1, conocida como la banda de amida II, es atribuible al péptido bonos vibraciones en proteínas 33,34. En el caso considerado, esta banda representa una superposición de los modos de vibración de GBP inmovilizadas en la superficie de Ni entre función Ags, y es indicativo de la mejora de SERS de estos modos en la zona de nanoestructuras de metales nobles cuando se usan los sustratos que contienen nano-puntos o nano-hexágonos. Esta banda es muy débil para la proteína en solución en ausencia de mejora SERS (Figura 5B) y ausente en los cojines de Ag sin la superficie de Ni disponible para la proteína de unión, pero es bien pronunciado para sustratos nanoestructurados con alguna superficie Ni accesibles para la proteína para unirse. Sin embargo, aún más importante para el presente estudio son las otras bandas, más estrechos alrededor de aproximadamente 2900 cm -1 que se pueden atribuir al enlace CH wibrations 32,33. El espectro de libre de glucosa GBP muestra una banda pronunciada a 2933 cm -1 con el sustrato nano-puntos, y una banda débil pero discernible en una longitud de onda similar con el sustrato nano-hexágonos (Figura 10A). A diferencia del caso de la proteína libre de glucosa, los espectros SERS de la glucosa unida a GBP muestra en la Figu re 10B exhibición dos bandas correspondientes a CH regímenes bonos vibraciones, a 2.850 cm -1 y 2910 cm -1. Las bandas están bien pronunciadas en el espectro de GBP glucosa unida en sustrato nano-hexágonos, y también se pueden ver en el espectro de GBP sobre el sustrato nano-puntos. La banda a 2850 cm -1 es razonablemente cerca de los 2890 cm -1 uno en el espectro Raman de control de D-glucosa en solución, y por lo tanto se puede atribuir a la glucosa unido a la proteína, mientras que la otra banda (en 2910 cm -1) es atribuible a las vibraciones CH bonos tanto de la proteína y glucosa. Se puede concluir que la diferencia de firmas SERS de destino a la glucosa libre de glucosa y el sustrato inmovilizado GBP es observable en esta región, y las vibraciones CH bonos de glucosa unida a proteínas son detectables empleando el diseño descrito. 10.jpg "/> Figura 10. espectros SERS de ligando libre (A) y (B) la proteína de unión de glucosa unido al ligando inmovilizado sobre tres sustratos diferentes en Diseño 2. Los espectros se obtuvieron con 780 nm de excitación de longitud de onda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra. En Diseño 3, el aptámero de unión a la dopamina personalizado (DBA) con terminación tiol 23 se inmoviliza en el sustrato en solución tampón tris (hidroximetil) aminometano (TRIS) ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), y la dopamina se une entonces a la aptámero inmovilizado 19. Los sustratos para este diseño contienen matrices de Au nano-hexágonos en FS (Figura 6C). No estructurados Au almohadillas (Figura 6E) también se utilizan para fines de control. Dado que el ADN es intrínsecamente fluorescente 38, 780 nm de excitación waveleng ésimo se utiliza en Design 3 para reducir este factor. En este diseño, el elemento de reconocimiento (aptámero) no está activo Raman en la región de los cambios de Raman considerados en la Figura 11, mientras que la dopamina muestra una actividad Raman significativa en esta región. Dado que la señal de las muestras expuestas a sólo dopamina sin aptámero inmovilizado no muestra bandas de dopamina resultantes 19, se espera que las bandas de SERS observados para originar de dopamina aptámero de ruedas. Figura 11 compara los espectros SERS de aptámero inmovilizado en nanoestructuras de oro antes y después de la adición de dopamina. Como era de esperar, inmovilizado aptámero-dopamina libre no presenta bandas Raman. En contraste, un número de bandas Raman pronunciadas se observan para aptámero inmovilizado dopamina de ruedas. Las posiciones de la mayoría de las bandas de la Figura 11 son cercanos a los de la dopamina cristalina, aunque con diferencias en las amplitudes. igura 11 "src =" / files / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg "/> Figura 11. espectros SERS de ligando libre (línea morada) y ligando determinada (línea azul) aptámero inmovilizado sobre sustratos de Au nano-hexágono en Diseño vinculante dopamina-3 19. La línea roja muestra un espectro SERS control del polvo de la dopamina. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.