Surface Enhanced Raman Spectroscopy Rilevamento di Biomolecole Utilizzando EBL manufatti nanostrutturati Substrati

Raccolta di controllo spettri Raman dei componenti principali, comprese proteine ​​libere in soluzione e leganti liberi in soluzione o in polvere senza utilizzare substrati contenenti metalli, è importante per consentire un corretto confronto e per scopi di interpretazione. Figura 5A presenta un tipico Raman spettro per le proteine ​​gratis A in acqua deionizzata su un vetrino, senza supporti nanostrutturati. Due bande con l'intensità Raman più alto, la banda a 2.931 centimetri -1 ea 1.091 centimetri -1, corrispondono alle vibrazioni che coinvolgono legami CH e CS, rispettivamente. Altre band con una minore intensità Raman come 563 centimetri -1, 1.450 centimetri -1, 1.653 centimetri -1 e 2.426 centimetri -1, può essere attribuito ad una sovrapposizione di modi di vibrazione 18,32,33,34. Controllo spettri Raman per il ligando GPB libera in soluzione tampone con tre differenti concentrazioni, 0,3, 0,9 e 1,3 mm, sono mostrati in Figura 5B. In t egli figura, la banda larga circa 3.400 cm-1 corrisponde al solvente 35, mentre la banda a 2.935 centimetri -1 rappresenta vibrazioni che coinvolgono legami CH della proteina 32,33. Figura 5C mostra l'elevata lunghezza d'onda Raman spettro per D-glucosio in soluzione tampone per diverse concentrazioni: 1, 6, 100, 200, e 400 mM. Quando si aumenta la concentrazione di glucosio, bande legami CH vibrazioni nascono a 2.890 centimetri -1 e 2.960 centimetri -1. Controllo spettri Raman di dopamina in cristalli ottenuti con entrambe le lunghezze d'onda di eccitazione 532 nm e 780 nm sono mostrati in Figura 5D. Gran parte dello spettro Raman viene dal benzenico flessione e tratti obbligazionari CH della molecola 19,36. Alcune delle bande a circa 3000 cm -1 sono osservati solo a 532 nm ma non di eccitazione 780 nm lunghezza d'onda. PLOAD / 52712 / 52712fig5.jpg "/> Figura 5. Controllo Raman spettro di proteina A in acqua deionizzata ottenuta a 532 nm di lunghezza d'onda di eccitazione 18 (A); Spettri Raman di glucosio proteina legante senza ligando in soluzione tampone ottenuta a 532 nm di lunghezza d'onda di eccitazione (B); Spettri Raman di D-glucosio in soluzione tampone ottenuta a 532 nm di lunghezza d'onda di eccitazione (C); e spettri di polvere ottenuta dopamina a 532 nm e 780 nm lunghezza d'onda di eccitazione 19 (D). Tutti gli spettri sono regolarmente spettri Raman di soluzioni (a, b, c) e polvere (d) su vetrini senza substrati nanostrutturati. In (D), l'assegnazione di Raman regimi passaggio a diverse vibrazioni molecolari è stato fatto utilizzando Generale atomica e molecolare elettronica Sistema Structure (GAMESS) 30 e software MacMolPlt 31 come descritto altrove 19. Pannello Ristampato (a) con il permesso di 18 Americuna società di vuoto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Per ottenere spettri SERS per biomolecole superficiali immobilizzato, substrati comprendenti nanostrutture metalliche su supporti silice fusa sono fabbricati come descritto ai punti 1-3. La qualità di substrati fabbricati è controllata mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Le procedure SEM standard sono descritte altrove 16,17,18, 19 e non inclusi nel presente protocollo. La figura 6 mostra immagini rappresentative SEM di Au e Ag nano-punti e nano-esagonale come strutture (pannelli ad), così come non -structured Au e Ag pastiglie (pannelli E e F, rispettivamente). Le prossime tappe prevedono l'immobilizzazione di materiale biologico sui substrati nanostrutturati impiegano tre disegni di cui alla tabella 1, e l'acquisizione di loro spettri SERS. In o rder per mantenere un ambiente acquoso durante l'imaging Raman, ciascun campione è posto nella soluzione corrispondente (vedere Tabella 1), ricoperto con una copertura in vetro sottile, e sigillato, come illustrato nella Figura 7. Figura 6. Microscopio elettronico a scansione (SEM) le immagini di 10 di spessore Au e Ag nanostrutture superficiali nm impiegati come substrati SERS: (A, B) array di nanodots; (C, D) array di nano-esagoni; (E, F) pastiglie non strutturati. Substrati con strutture Au (a sinistra) impiegano supporti FS, mentre sottofondi con strutture Ag (a destra) utilizzano un rivestimento 10 nm di spessore Ni sul FS. Le immagini sono state ottenute come descritto altrove 16,17,18.pg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 7. Schema della camera a prova di acqua per l'imaging Raman di campioni bio-funzionalizzate in soluzione. In Design 1, la proteina ricombinante A è immobilizzato su substrati funzionalizzati da un monostrato auto-assemblato di 11-mercaptodecanoic acido (MUA) in acqua deionizzata 18. I substrati in questo disegno comprendono tre matrici di Au punti con un passo di 50 nm e distanze variabili inter-dot su silice fusa (vedi figure 6A e 8). Il processo di proteine ​​immobilizzazione inizia con la formazione di un SAM sui substrati. Per ottenere vincolante tra il SAM e la proteina covalente, i gruppi acidi carbossilici di SAM vengono trasformati in ammina reattiva NHS-estere mediante trattamento con una miscela di N </em> -ethyl- N '- (3- (dimetilammino) propil) carbodiimide (EDC) Soluzione N -hydroxysuccinimide (NHS) in acqua deionizzata e soluzione. Immobilizzazione di proteina A avviene mediante spostamento del gruppo NHS da residui di lisina della proteina 37. Un esempio di campioni di imaging per Design 1 con proteina A immobilizzata su Au nanostrutture è mostrato nella Figura 9. Figura 9A presenta un'immagine al microscopio ottico dei campioni, che comprendono tre matrici di bio-funzionalizzati Au nanodots con differenti gap inter-dot (vedi anche le figure 3AA e 8), e la Figura 9B mostra la mappatura spettrale Raman su queste matrici. Si può notare che i più alti intensità Raman si riscontrano per Array I se le lacune tra punti sono il più stretto, mentre le intensità inferiori sono ottenuti per Array III con i più ampi divari tra punti. Questo può essere spiegato con un effetto di accoppiamento plasmon forte prodotta da maggiori fie elettricoLDS negli spazi ristretti tra i punti 18. Figura 9C mostra la forte spettri SERS ottenuto per Arrays I e II. Gli spettri presentano diverse bande (1.630 centimetri -1, 1.964 centimetri -1, 2.280 centimetri -1, 2.577 centimetri -1, e 2.916 centimetri -1) in prossimità dei modi Raman di proteine ​​libero A in soluzione visto in Figura 5A. Attribuibile a vibrazioni di varie obbligazioni presenti in proteine, queste bande o appaiono in luoghi simili in entrambi proteina immobilizzata e in soluzione, o sono leggermente spostati a numeri d'onda leggermente più alte quando immobilizzato. Al contrario, SERS spettri di substrati nanostrutturati simili funzionalizzata da MUA SAM senza la proteina mostrano un modello completamente diverso 18, confermando che la figura 9 rappresenta la mappatura SERS di superficie immobilizzato proteina A. Cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura. Figura 8. immagini SEM di tre matrici di Au nanodots su substrato FS utilizzati in Design 1 18. Gli array hanno lo stesso passo di 50 nm e leggermente diversi raggi dot causando diverse larghezze di gap inter-dot. Ciò viene ottenuto applicando differenti dosi di esposizione EBL per produrre maschere PMMA per le tre matrici (vedi Tabella 1). Dosi di esposizione più alti producono ampi fori in maschere in PMMA, consentendo di dimensioni maggiori punti Au dopo metallizzazione e decollo. Ristampato con il permesso di 18 società Vacuum americano. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. les / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg "/> Figura 9. SERS immagini di substrato-immobilizzato proteina A in Design 1 18. (A) immagine ottico microscopio del campione, costituito da tre matrici di Au nanodots con passo 50 nm e diverse lacune tra punti su un substrato di silice fusa (vedi anche Figura 6), bio-funzionalizzati come mostrato nella Figura 3A. (B) mappatura Raman del campione. (C) SERS spettri Array dot I e II. Nel grafico (B), l'asse verticale rappresenta la distanza attraverso il substrato, l'asse orizzontale rappresenta lo spostamento Raman, e la legenda barra indica le intensità Raman. Vertical linee tratteggiate in pannelli (B) e (C) rappresentano bande Raman benchmark di proteine ​​libero A in soluzione e (*) a pannello (C) indica bande SERS da Array I. Il Raman spettri sono stati ottenuti 532 nm di eccitazionelunghezza d'onda. Ristampato con il permesso di 18 società Vacuum americano. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. In Design 2, glucosio ricombinante proteina legante (GBP) 21 complessato con D-glucosio (ligando) viene immobilizzato su substrati appropriati in soluzione tampone fosfato di potassio. I campioni con immobilizzato GBP senza leganti sono anche preparati per il confronto. In questo disegno, la proteina di legame-glucosio è collegata alla superficie mediante una variabile istidina, che si lega bene a Ni ma non ai metalli nobili 6. Dal momento che i substrati comprendono matrici di Ag nano-dots, nano-esagoni, e pastiglie Ag non strutturati su FS Ni-rivestite (figure 6B, 6D, e 6F, rispettivamente), ci si può aspettare più di molecole proteiche immobilizzati per essere collocata in spazi tra Ag nanostrutture dove rivestimento Ni è available. Gli spettri Raman ottenuto per immobilizzato senza glucosio e glucosio-bound GBP sono mostrati nelle Figure 10A e 10B, rispettivamente. Tutti questi spettri mostrano una larga banda a circa 3300 cm-1, che corrisponde alla soluzione tampone 35. Gli spettri ottenuti con un rilievo strutturato Ag contiene solo questa singola band e non mostrano modi di vibrazione delle proteine, che conferma che la proteina immobilizzata non si trova sulla superficie Ag come previsto. Al contrario, gli spettri ottenuti con array di Ag nano-punti e bande mostrano nano-esagoni intorno 1.550 centimetri -1 e 2.900 cm -1, che rappresentano il 32,33 analita. In particolare, la banda larga circa 1.550 centimetri -1, nota come banda amide II, è attribuibile al peptide obbligazioni vibrazioni nelle proteine ​​33,34. Nel caso in esame, questa banda rappresenta una sovrapposizione dei modi di vibrazione da GBP immobilizzati sulla superficie Ni tra funzionalità Ags, e è indicativo di valorizzazione SERS di queste modalità in prossimità di nanostrutture di metalli nobili quando si utilizzano i substrati contenenti nano-punti o nano-esagoni. Questa banda è molto debole per la proteina in soluzione in assenza di enhancement SERS (Figura 5B) e assente pastiglie Ag senza Ni superficie disponibile per il legame della proteina, ma è ben pronunciata per substrati nanostrutturati con qualche superficie Ni accessibili per la proteina per legare. Tuttavia, ancora più importante per il presente studio sono le altre, le bande più strette intorno a circa 2.900 centimetri -1 che possono essere attribuiti al legame CH wibrations 32,33. Lo spettro di GBP privo di glucosio mostra una banda pronunciato a 2.933 centimetri -1 con il substrato nano-puntini, e una banda debole ma percepibile alla lunghezza d'onda simile con il substrato nano-esagoni (Figura 10A). Distinto dal caso di proteine ​​libera glucosio, gli spettri SERS di GBP glucosio-bound mostrato in Figu ri 10B mostra due bande corrispondenti a CH obbligazioni vibrazioni regimi, a 2.850 centimetri -1 e 2.910 centimetri -1. Le bande sono ben pronunciate nello spettro di glucosio-bound GBP su substrato nano-esagoni, e possono anche essere viste nello spettro di GBP su nano-dots substrato. La banda a 2.850 centimetri -1 è ragionevolmente vicino ai 2.890 centimetri -1 uno nello spettro Raman di controllo da D-glucosio in soluzione, e quindi può essere attribuito al glucosio legato alla proteina, mentre l'altro gruppo (a 2910 centimetri -1) è attribuibile a vibrazioni obbligazioni CH sia della proteina e glucosio. Si può concludere che la differenza di firme da SERS senza glucosio e glucosio-bound substrato-immobilizzato GBP è osservabile in questa regione, e le vibrazioni obbligazionari CH di glucosio legato alle proteine ​​sono rilevabili utilizzando il disegno descritto. 10.jpg "/> Figura 10. SERS spettri (A) senza legante e ligando-bound (B) la proteina-glucosio legante immobilizzato su tre diversi supporti in Design 2. Gli spettri sono stati ottenuti con 780 nm di eccitazione lunghezza d'onda. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. In Design 3, l'aptamero vincolante dopamina personalizzato (DBA) con terminazione tiolo 23 è immobilizzato sul substrato in tris (idrossimetil) amminometano (TRIS) acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) soluzione tampone, e la dopamina viene quindi associata al aptamer immobilizzato 19. I substrati per questo disegno contengono array di Au nano-esagoni su FS (Figura 6c). Non strutturati Au pastiglie (Figura 6 sexies) sono utilizzati anche per fini di controllo. Dal momento che il DNA è intrinsecamente fluorescenti 38, 780 nm di eccitazione waveleng th è utilizzato in Design 3 per ridurre questo fattore. In questo disegno, l'elemento di rilevazione (aptameri) non è attiva Raman nella regione dei turni Raman considerati nella Figura 11, che mostra la dopamina una significativa attività Raman in questa regione. Poiché segnale da campioni esposti solo dopamina senza aptamer immobilizzato non mostra bande dopamina risultanti 19, le bande SERS osservati dovrebbero provenire da dopamina aptamer-bound. Figura 11 confronta gli spettri SERS di aptamero immobilizzato su nanostrutture oro prima e dopo l'aggiunta di dopamina. Come previsto, immobilizzato aptamer senza dopamina non presenta bande Raman. Al contrario, un numero di bande Raman pronunciate si osservano per la dopamina legata aptamer immobilizzato. Le posizioni di maggior bande in Figura 11 sono vicine a quelle dopamina cristallina, sebbene con differenze di ampiezze. IGURA 11 "src =" / files / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg "/> Figura 11. SERS spettri privi di legante (linea viola) e ligando-bound (linea blu), la dopamina vincolante aptamer immobilizzato su Au substrati nano-esagonali in Design 3 19. La linea rossa indica uno spettro di controllo SERS di polvere dopamina. Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.