الخلية المجهرية الدقيقة-تسليط غشاء (النواب) هي الحويصلات البيولوجية النشطة التي يمكن أن تكون معزولة وآثارها المرضية في جسم المريض التحقيق في نماذج مختلفة. نحن هنا تصف طريقة لتوليد النواب المستمدة من الخلايا الليمفاوية T (LMPS) ولإظهار تأثير proapoptotic على الخلايا الظهارية مجرى الهواء.
تزايد الاهتمام في الأدوار البيولوجية للخلية الحويصلات المشتقة من الغشاء في التواصل خلية خلية في السنوات الأخيرة. المجهرية الدقيقة (النواب) هي واحدة مثل هذا النوع من الحويصلات، والتي تتراوح قطرها من 0.1 ميكرومتر إلى 1 ميكرومتر، وتسلط عادة من غشاء البلازما من خلايا حقيقية النواة تمر تفعيل أو موت الخلايا المبرمج. نحن هنا وصف جيل من T-المستمدة اللمفاويات المجهرية الدقيقة (LMPS) من خلايا CEM T أفكارك حفز مع أكتينوميسين يتم عزل D. LMPS من خلال عملية الطرد المركزي التفاضلي متعددة الخطوات، وتميزت باستخدام التدفق الخلوي. ويعرض هذا البروتوكول أيضا في الموقع موت الخلايا طريقة الكشف لإثبات تأثير proapoptotic من LMPS على الخلايا الظهارية الشعب الهوائية المستمدة من الماوس الابتدائية الجهاز التنفسي إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة توفر الإجراء استنساخه لعزل كميات وفيرة من LMPS من الخلايا الليمفاوية أفكارك في المختبر. المستمدة LMPSفي هذه الطريقة يمكن استخدامها لتقييم خصائص النماذج المرض المختلفة، والصيدلة وعلم السموم الاختبار. وبالنظر إلى أن ظهارة الهوائية تقدم حاجز مادي وعملي وقائي بين البيئة الخارجية والأنسجة الكامنة، واستخدام إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية بدلا من خطوط الخلايا الظهارية خلد يوفر نموذج فعال للتحقيقات التي تتطلب الأنسجة المسالك الهوائية.
Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.1 MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.6
The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.7 We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,8 which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.
The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.
النواب هي سطاء نشطة من عبر الحديث بين الخلايا ودراستهم واعد في العديد من مجالات العلم. وقدمت هذه الدراسة 11 بروتوكول مفصلة لفي المختبر جيل واسع النطاق للLMPS المستمدة من خط الخلية T أفكارك. هؤلاء النواب تعبر عن ذخيرة كبيرة من الجزيئات اللمفاويات وتورط بيولوجي…
The authors have nothing to disclose.
ويؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (178918)، فون دي بحوث أون سانتيه كيبيك – الرؤية شبكة بحوث الصحية.
LMPs production and characterization | |||
CEM T cells | ATCC | CCL-119 | |
X-VIVO 15 medium | Cambrex, Walkersville | 04-744Q | |
Flask T75 | Sarstedt | 83.1813.502 | |
Flask T175 | Sarstedt | 83.1812.502 | |
Actinomycin D | Sigma Chemical Co. | A9415-2mg | |
PBS | Lifetechnologies | 14190-144 | |
0.22µm filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Annexin-VCy5 | BD Pharmagen | 559933 | |
FACS flow solution | BD Bio-sciences | 342003 | |
Fluorescent microbeads (1 um) | Molecular Probes | T8880 | |
Polysterene counting beads (7 um) | Bangs laboratories | PS06N/6994 | |
Polypropylene FACS tubes | Falcon | 352058 | |
1 ml pipet | Fisher | 13-678-11B | |
5 ml pipet | Falcon | 357543 | |
25 ml pipet | Ultident | DL-357551 | |
1,5 ml conical polypropylene micro tube | Sarstedt | 72.690 | |
15 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.554.205 | |
50 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
50 ml high speed polypropylene copolymer tube | Nalgene | 3119-0050 | |
250 ml high speed polypropylene bottle | Beckman | 356011 | |
Protein assay (Bradford assay) | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | |
Protein assay standard II | Bio-Rad Laboratories | 500-0007 | |
Test tube 16×100 | VWR | 47729-576 | |
Test tube 12×75 | Ultident | 170-14100005B | |
Cell incubator | Mandel | Heracell 150 | |
Low speed centrifuge | IEC | Centra8R | |
High speed centrifuge | Beckman | Avanti J8 | |
High speed rotor for 250ml bottle | Beckman | JLA16.250 | |
High speed rotor for 50ml tube | Beckman | JA30.50 | |
Fow cytometry | BD Bio-sciences | FACS Calibur | |
Spectrophotometer | Beckman | Series 600 | |
Bronchial tissue explants and sections | |||
C57BL/6 mice (5-7 weeks old) | Charles River Laboratories, Inc. | ||
Mouse Airway PrimaCell™ System: | CHI Scientific, Inc. | 2-82001 | |
Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades | Becton Dickinson AcuteCare | 371310 | #10 |
Scalpel Handle | Fine Science Tools Inc. | 10003-12 | #7 |
phase-contrast inverted microscope | Olympus Optical CO., LTD. | CK2 | |
high O2 gas mixture | VitalAire Canada Inc. | ||
modular incubator chamber | Billups-Rothenberg Inc. | MIC-101 | |
MaxQ 4000 incubated orbital shaker | Barnstead Lab-Line, | SHKA4000-7 | |
12-well tissue culture plate | Becton Dickinson and Company | 353043 | |
Plastic tissue culture dishes (100 mm) | Sarstedt, Inc. | 83.1802 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools Inc. | 14060-09 | Straight, sharp, 9cm longth |
Half-curved Graefe forceps | Fine Science Tools Inc. | 11052-10 | |
humidified CO2 incubator | Mandel Scientific Company Inc. | SVH-51023421 | |
Histopathological examination | |||
formalin formaldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | HT5011 | |
paraffin | Fisher scientific International, Inc. | T555 | |
ethyl alcohol | Merck KGaA, Darmstadt | EX0278-1 | |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | G6403 | |
Cacodylate | Sigma-Aldrich, Inc. | 31533 | |
microscope slides | VWR Scientific Inc. | 48300-025 | 25x75mm |
Xylene | Fisher scientific International, Inc. | X5-4 | |
Mayer's hematoxylin | Sigma-Aldrich, Inc. | MHS16 | Funnel with filter paper |
HCl | Fisher scientific International, Inc. | A144s-500 | |
eosin | Sigma-Aldrich, Inc. | HT110116 | Funnel with filter paper |
Permount™ Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific Inc. | SP15-100 | |
glass coverslip | surgipath medical industries, Inc. | 84503 | 24×24 #1 |
TUNEL detection kit | In Situ Cell Death Detection, POD | 11 684 817 910 | |
oven | Despatch Industries Inc. | LEB-1-20 | |
rotary Microtome | Leica Microsystems Inc. | RM2145 | |
filter paper | Whatman International Ltd. | 1003150 | #3 |
Microscope | Nikon Imaging Japan Inc. | E800 | |
staining dish complete | Wheaton Industries, Inc. | 900200 | including dish, rack, cover |
1.5 ml eppendorf tube | Sarstedt Inc. | 72.69 | 39x10mm |
Orbital and Reciprocating Water Bath | ExpotechUSA | ORS200 | |
phosphate buffered saline | GIBCO | 14190-144 | |
fume hood | Nicram RD Service | 3707E |