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Biology

Mejorado el análisis genético de Soltero biopartículas Humanos Recuperadas por simplificado Micromanipulación de Evidencia Forense 'Touch ADN'

Published: March 09, 2015
doi:
10.3791/52612
, ,
1Forensic Science Graduate Program, Biochemistry Track,University of Central Florida, 2Department of Chemistry,University of Central Florida, 3National Center for Forensic Science,University of Central Florida

Summary

Aquí se describe una estrategia de extracción optimizado y eficiente para la recogida de bio-partículas presentes en "toque de ADN 'muestras, junto con un protocolo de amplificación mejorada que implica un / STR amplificación de un solo paso 5 l micro-volumen de lisis, para permitir la recuperación de repetición corta en tándem (STR) perfiles del donante (s) bio-partícula.

Abstract

Los perfiles de ADN se pueden obtener a partir de pruebas "toque de ADN ', que comprende trazas microscópicas de material biológico humano. Los métodos actuales para la recuperación de ADN rastro hisopos de algodón empleo o cinta adhesiva para degustar un área de interés. Sin embargo, un enfoque de este tipo "blind-hisopado 'co-muestra de material genético molecular de los diferentes individuos, incluso si las células de los individuos se encuentran en lugares geográficamente distintos en el artículo. Por lo tanto, algunas de las mezclas de ADN encontradas en muestras de ADN táctiles son creados artificialmente por el hisopado en sí. En algunos casos, el ADN de una víctima puede ser encontrada en exceso significativo enmascarando así DNA de cualquier agresor potencial.

Con el fin de eludir los retos con los métodos de recuperación y análisis estándar, hemos desarrollado un menor costo, método de "análisis inteligente" que se traduce en el análisis genético mejorado de las pruebas de ADN toque. Describimos un un optimizadod eficiente estrategia de recuperación de micromanipulación para la recogida de bio-partículas presentes en muestras de ADN táctil, así como una estrategia de amplificación mejorada que implica un solo paso 5 l amplificación lisis microvolumen / STR para permitir la recuperación de perfiles STR del donante bio-partícula (s). El uso de la persona o pocos (es decir, "grumos") biopartículas resultados en la capacidad de obtener perfiles de origen individuales. Estos procedimientos representan técnicas mejoradas alternativas para el aislamiento y análisis de biopartículas individuales de las pruebas de ADN toque forense. Aunque no es necesario en cada investigación forense, el método podría ser muy beneficioso para la recuperación de un perfil de ADN autor de una sola fuente en los casos de asalto físico (por ejemplo, la estrangulación) que no puede ser posible mediante técnicas de análisis estándar. Además, las estrategias desarrolladas aquí ofrecen la oportunidad de obtener la información genética en el nivel de células individuales a partir de una variedad de oTher rastro no forense material biológico.

Introduction

ADN Touch es una forma de evidencia biológica rastro que es la transferencia directa de material celular (por ejemplo, eliminar las células de la piel) de un individuo a un objeto u otra persona durante el contacto físico 1. La capacidad de obtener perfiles de ADN a partir de una variedad de objetos tocados (documentos, ropa de cama, zapatos, armas de fuego, vasos, bolígrafos, maletín manijas) se ha reportado en la literatura 2-9.

Un factor crítico en el análisis de las pruebas de ADN tacto es el éxito de la recuperación de la traza material biológico presente. Touch pruebas de ADN se recoge normalmente con un hisopado de la zona sospechosa con un algodón estéril (referido como "ciego-hisopado"). Usando este enfoque, la naturaleza del material biológico recolectado no se conoce y se realiza el muestreo de un área generalizada. La presencia de surcos superficiales o grietas puede impedir el éxito de la recuperación de la frecuencia ya pequeña cantidad de bimaterial de ological presente. Además, un enfoque de "ciego-hisopado" voluntad material celular necesariamente co-muestra de los diferentes individuos cuyas células están presentes en el artículo, incluso si las células de los individuos se encuentran en lugares espacialmente distintas sobre el tema. La recuperación de los perfiles de ADN mezclados, que a menudo son difíciles de resolver en particular con muestras de ADN de bajo plantilla, se observa con frecuencia 8,10,11 y en muchos casos será un artefacto consecuencia del proceso de hisopado sí mismo. Si sólo una pequeña cantidad de material estuvo presente desde uno de los donantes, técnicas de extracción y análisis estándar pueden fallar para recuperar un perfil de la contribuyente menor. Además, el tipo de hisopo o si se utilizó seco o húmedo (pre-humedecido con agua estéril) puede influir en la cantidad de material biológico, que se recaba debido a diferencias en la capacidad de absorción y capacidad de adsorción y la eficacia de liberación del material biológico 12. Smétodos de extracción tandard pueden resultar en la pérdida de muestra adicional debido a la manipulación física que se requiere de los pasos de ejemplo o de transferencia de la muestra.

Como se describió anteriormente, las técnicas de hisopado simples para la recuperación de material biológico pueden resultar en la pérdida de cantidades traza de muestra biológica, así como una mayor incidencia de perfiles mezclados debido a un fallo para separar los componentes biológicos individuales. Por lo tanto, hemos tratado de desarrollar estrategias más selectivas y eficientes de recuperación para la recolección de micropartículas celulares presentes en objetos tocados. La estrategia desarrollada para el análisis de material biológico de las pruebas de ADN touch (referido aquí como "biopartículas" debido al hecho de que un núcleo no siempre es visible ya que la mayoría de las células que se encuentran en la capa epidérmica exterior de la piel están muertos o moribundos queratinocitos 13) consiste en lo siguiente: 1) la recolección de material biológico (es decir, las biopartículas) a través fr gel de películaom tocó objetos y superficies, prendas desgastadas o piel humana directa, 2) El examen microscópico del material biológico recuperado para asegurar la recolección de material biológico humano potencial, y 3) de micromanipulación de bio-partículas individuales o pocos utilizando un adhesivo soluble en agua, y 4) los perfiles de ADN autosómico-STR de los bio-partículas recolectadas utilizando un microvolumen (5 l) de un solo paso de lisis / reacción de amplificación.

Este procedimiento ofrece numerosas ventajas sobre los métodos de análisis utilizados tradicionalmente. Recuperación de biopartículas utilizando el gel de película permite a un examen microscópico del material biológico presente en la muestra antes del análisis. Si bien la mayoría de las biopartículas recuperados de las pruebas de ADN contacto puede no ser células nucleadas lo que hace más difícil determinar qué o cuántas se deben seleccionar bio-partículas, el examen microscópico de las muestras antes del análisis proporciona a la oportunidad para buscar células nucleadas así maximizing la probabilidad de recuperación perfil de ADN. La colección de biopartículas utilizando adhesivo soluble en agua micromanipulación asistida permite la transferencia directa de biopartículas específicas en tubos de reacción. Este procedimiento se visualizó bajo el microscopio para asegurar la transferencia exitosa del material biológico. La reacción reducido o microvolumen aumenta la sensibilidad al tiempo que reduce el costo de análisis por muestra. Esto permite el análisis de un mayor número de muestras de un elemento de prueba. Debido a la variedad en el estado genético de los bio-partículas en las pruebas de ADN toque, se recomiendan múltiples muestreos de artículos individuales.

Aquí, nos demuestran el uso exitoso de los protocolos desarrollados para obtener perfiles genéticos altamente probatorios de los donantes de material biológico en las pruebas de ADN toque. Los métodos de perfiles de recolección biopartícula desarrollado y ADN proporcionan una completa "inteligente" (es decir, específicos, medibles, attaenfoque Enable, realista y oportuna) molecular basado en la caracterización, análisis e interpretación de material biológico rastro. Aunque originalmente desarrollado para su aplicación en el análisis forense de las pruebas de ADN tacto, las estrategias desarrolladas aquí se pueden aplicar a otras fuentes de material biológico y ofrecen la oportunidad de obtener información de identificación individual en el nivel de células individuales.

Protocol

NOTA: Los líquidos corporales se obtuvieron de voluntarios utilizando procedimientos aprobados por la Universidad de la Junta de Revisión Institucional de la Florida Central. Consentimiento informado, se obtuvo de cada donante. 1. Recolección de biopartículas de objetos y superficies que se tocan Cortar el gel de película al tamaño deseado. Asegúrese de que es el tamaño adecuado para el portaobjetos de microscopio de vidrio que se utiliza como soporte sólido. Por ejemplo, para una "x 1" portaobjetos de vidrio 3, utilizar un tamaño de gel de película de 2 "x 0,75". NOTA: La longitud y la anchura del material puede reducirse, si se desea, pero no debe exceder este tamaño. Remueva la capa blanca del gel de película y una el gel-película al portaobjetos de microscopio (Figura 1). Presione firmemente para asegurar una unión completa. NOTA: Hay una capa protectora superior claro que no se debe quitar para permitir que se aplique presión a lo largo de la pieza de gel-film sin contaminar la superficie del gel de película. Diapositivas gel película preparada (con capa protectora adjunta) se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta que se necesite. Retire la película protectora superior transparente del gel de película con unas pinzas estériles cuando esté listo para usar (Figura 1B) la muestra de gel-película. Coloque la superficie del gel de película en contacto directo con el objeto deseado tocado o superficie (Figura 2). Aplique una pequeña cantidad de presión para asegurar la transferencia eficiente de bio-partículas de gel-película. NOTA: Si se aplica demasiada presión, el portaobjetos de vidrio podría romperse. NOTA: múltiples muestreos desde el mismo objeto o superficie se pueden recoger en la misma pieza de gel de película. Confirme la transferencia de bio-partículas en el gel-film (Figura 3) colocando el portaobjetos en un microscopio estereoscópico (trans o epi-iluminación se pueden utilizar). Uso magnificación de 20X ~ de las mejores zonas de mayor tamaño de visualización del gel de película, y la ampliación de ~ 200X para mejor viewing bio-partículas individuales. Guarde la diapositiva muestra de gel de película a temperatura ambiente en una caja portaobjetos cubierta o utilizar de inmediato para la tinción y o colección / bio-partícula. 2. La tinción opcional de biopartículas para ayudar en la visualización Coloque la diapositiva muestra de gel-película preparada en el paso 1 en una parrilla corrediza mancha sobre un fregadero. Usando una pipeta de transferencia desechable, cubrir toda la superficie del gel de película con tinción de azul de tripano (Figura 4A). Incubar a temperatura ambiente durante 1-2 min. Retire el exceso de colorante por la inclinación del tobogán para que la mancha se escurra en el fregadero (Figura 4B). NOTA: La diapositiva se puede aclarar por las inundaciones suave con agua estéril utilizando una pipeta de transferencia desechable si es necesario (Figura 4C). Permitir el portaobjetos se seque al aire antes de proceder al aislamiento de los bio-partículas. Ver el portaobjetos con un microscopio estereoscópico (~ 20X para la visión global y ~ 200-300X a vbiopartículas individuales IEW) para asegurar la tinción adecuada (Figura 4D-E). NOTA: La diapositiva se puede almacenar a temperatura ambiente en una caja portaobjetos cubierto. 3. El aislamiento de las biopartículas de interés para el análisis Coloque el número apropiado de 0,2 ml tubos de PCR en un bastidor y etiquetar los tubos adecuadamente. Preparar la mezcla de amplificación STR (ver Lista de Materiales) en una campana de amplificación por PCR designado o gabinete de bioseguridad. Vortex la mezcla maestra bien y centrifugar brevemente en una mini-centrífuga. El volumen de mezcla de amplificación necesaria por muestra es de 3,5 l; preparar un volumen apropiado de mezcla maestra para el número deseado de muestras. Pipetear 3,5 l de mezcla de amplificación en cada tubo de 0,2 ml. Tapar cada tubo sin apretar. Coloque un pedazo de cinta adhesiva doble sobre un portaobjetos de vidrio limpio o directamente sobre un bloque de vidrio. NOTA: Esto se utiliza para mantener laTubo de 0,2 ml en su lugar durante la recogida de muestras. Coloque un pedazo de cinta adhesiva doble sobre un portaobjetos de vidrio limpio. Coloque un pedazo de cinta de soldadura de ola soluble en agua en la parte superior de la cinta adhesiva doble. NOTA: Esta diapositiva puede ser almacenado en un desecador para uso futuro. Coloque el primer tubo de 0,2 ml en la doble cara cinta de palo o de bloques preparado en el paso 3.4. Establezca este tubo a un lado hasta que se tomó la muestra. Coloque la soldadura de ola de diapositivas cinta soluble en agua bajo el microscopio (ampliación baja). Con la punta de una aguja de tungsteno, raspar suavemente la superficie de la cinta con el fin de recoger una pequeña cantidad (o "bola") de adhesivo en el extremo de la aguja (Figura 5A). NOTA: El tamaño de la bola puede ser pequeño o grande dependiendo del número de biopartículas que serán recogidos. Retire cuidadosamente la aguja de tungsteno con adhesivo de bajo el microscopio sin molestar a la punta de la aguja. La aguja puedeser el lugar en un estante si se desea durante la colocación de la muestra. Colocar la muestra preparada de gel de película (de los pasos 1 y 2) en la platina del microscopio. Ajuste el enfoque y la ampliación hasta las biopartículas pueden ser fácilmente visualizados. Identificar los bio-partículas que serán recogidos. NOTA: un bloque de vidrio se puede utilizar para apoyar la diapositiva si es necesario. Recuperar la aguja de tungsteno con el balón de adhesivo, y colocar la aguja sobre la superficie del gel de película donde se encuentran los bio-partículas de interés. Presione la punta de la aguja (con adhesivo) hacia abajo de manera que está en contacto con el bio-partícula (Figura 5B). Levante la aguja hacia arriba para garantizar que el bio-partículas se ha recogido. Repita este proceso hasta que se ha recogido el número deseado de bio-partículas. Coloque el preparado de 0,2 ml tubo de PCR en la platina del microscopio. Ajuste la ampliación de modo que el fondo del tubo que contiene la mezcla de amplificación está en el foco. Introduzca con cuidado el Needl tungstenoe en el tubo de 0,2 ml PCR hasta que la punta de la aguja está en la mezcla de amplificación. NOTA: Esto se realiza mejor mientras observa a través del microscopio. Mantenga la aguja en la mezcla de amplificación hasta que se disuelve el adhesivo y el biopartículas se liberan en solución (Figura 5C). Retire la aguja, coloque los 0,2 ml en posición vertical y sin apretar tapar el tubo. Repita el procedimiento de recogida de muestras adicionales. Limpie la aguja de tungsteno con alcohol pre-humedecido (isopropanol) toallitas entre muestras. 4. Combinado microvolumen Nucleic Acid Aislamiento (lisis directa) y autosómica Short Tandem Repeat (STR) Perfilado Preparar el tampón de lisis (ver Materiales) en una campana de amplificación por PCR designado o gabinete de bioseguridad. Añadir 1,5 l de tampón de lisis a cada tubo para un volumen de reacción total de 5 l. Cerrar el tubo de tapas herméticamente. NOTA: Los tubos de 0,2 ml ya contienen 3,5 l de lamezcla de amplificación y la colección bio-partículas desde el paso 3. Colocar las muestras en el termociclador y amplificar las muestras usando las siguientes condiciones de ciclo: 75 ° C durante 15 minutos; 95 ° C durante 11 minutos; 34 ciclos de 94 ° C durante 20 seg y 59 ° C durante 3 min; 60 ° C durante 10 min; y mantenimiento a 4ºC. Productos de amplificación se almacena a 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo. 5. La detección del producto – electroforesis capilar (CE) En una placa de 96 pocillos, añadir 10 l de mezcla CE consecutivo (9,7 l de formamida desionizada y el tamaño estándar de 0,3 l, ver Materiales). Añadir 1 l de producto amplificado o una escalera alélica a cada pocillo. PRECAUCIÓN: La formamida es un mutágeno potencial y debe ser manejado en una campana química mientras que use el equipo de protección personal adecuado. Utilice condiciones electroforéticas especificados por el fabricante en el manual del kit de amplificación o internally validado condiciones. Analizar los datos en bruto con software de análisis de STR.

Representative Results

Imágenes representativas de biopartículas individuales y agrupadas que se recuperaron a partir de un cuello de la camisa (100% poliéster) usado por un donante masculino se muestran en la Figura 6 (biopartículas individuales) y la Figura 7 (biopartículas agrupadas). Las biopartículas se recuperaron de la cuello de la camisa usando el protocolo descrito aquí: transferencia de biopartículas desde el cuello de la camisa de gel de película a través del contacto directo, la tinción de las biopartículas recuperados con azul de tripano, la recogida de muestras de biopartículas utilizando una aguja de tungsteno y el adhesivo soluble en agua y el análisis de STR ​​utilizando la amplificación 5 l micro-volumen de lisis / STR. Figuras 6 y 7 representan una muestra típica de biopartículas que ser analizada desde un elemento de ADN contacto individual (20 biopartículas individuales / dobles y de 20 biopartículas agrupadas). El biopartícula (s) recogidos en cada imagen están etiquetados con las mediciones de longitud y anchura (en micras). El percentage de alelos STR recuperados de cada una de las biopartículas (s) recogidos se proporciona en cada imagen individual para demostrar los grados variables de éxito que se puede esperar que se obtendrán de biopartículas con este tipo de pruebas. Las biopartículas recuperados de muestras de ADN táctiles son en gran parte los queratinocitos muertos o moribundos y por lo tanto un perfil de STR ​​probatorio no se obtuvo de cada biopartículas recogido, como se puede ver en las figuras 6 y 7. Para esta muestra cuello de la camisa, los perfiles STR se obtuvieron de 14/20 (70%) de las biopartículas individuales y 15/20 (75%) agrupados biopartículas. Sin embargo, cada uno de los perfiles recuperados rangos de valor probatorio: recuperación alelo 3-97% para los perfiles de biopartículas individuales y recuperación alelo 3-100% para los perfiles de biopartículas amontonados. Debido a la variabilidad en las tasas de éxito, se recomienda la recopilación de numerosos biopartículas de cada elemento de ADN toque. Esto asegura una mejor oportunidad de obtener un muy probatihe perfil STR. El perfil de STR ​​obtenido a partir de una de las muestras de biopartículas individuales del cuello de la camisa se ​​muestra en la Figura 8 (la biopartícula desde el que se originó el perfil se muestra a la izquierda). Casi un perfil de STR completo (28 de 30 alelos, uno locus abandonan, la precisión del perfil obtenido verificada por comparación con un perfil de referencia) se obtuvo de esta biopartículas individual. El perfil obtenido es de alta calidad, con alturas de pico inter-locus razonablemente equilibradas y no alélica de abandono. Alélica de abandono y artefactos altura pico no balanceada se observa frecuentemente con muestras de ADN bajo la plantilla. El perfil de STR ​​obtenido a partir de una de las muestras agrupadas de biopartículas del cuello de la camisa se ​​muestra en la Figura 9. Un perfil completo de STR ​​(30/30 alelos, la precisión del perfil obtenido verificada por comparación con un perfil de referencia) se obtuvo. Como se mencionó anteriormente, un perfil de STR no se recupera de Every biopartículas recogió. Un ejemplo de perfiles de ADN sin éxito de un solo biopartículas (recuperación alelo 3%, 1/30 alelos) se muestra en la Figura 10 (biopartículas individual). Si bien esto biopartícula individuo no tuvo éxito, perfiles STR una prueba convincente de que el donante de las biopartículas en esta muestra se obtuvieron de otras biopartículas recuperados de la misma muestra. Esto ilustra la necesidad de realizar múltiples muestreos sola célula / los grumos del mismo objeto. Los "inteligentes" métodos de análisis desarrollados aquí descritos para las pruebas de ADN táctil se han utilizado con éxito para recuperar perfiles sola fuente probatorios de una sola y biopartículas "agrupadas" de varios tocado objetos y prendas de vestir (por ejemplo, apoyabrazos de la silla, volantes de automóviles, teléfonos celulares, tazas de café, cigarrillos, bolígrafos, camisetas, pantalones cortos, y los suéteres). Sin embargo, de manera importante, este enfoque también se ha utilizado para la detección y el perfil de d machoonor ADN (fuente única) en las muestras de la mezcla física de contacto / asalto simulados (por ejemplo, autor agarrando la muñeca, el cuello o la ropa de la víctima, o el contacto con ropa de cama de la víctima como en las agresiones sexuales). Figura 1: Preparación de las placas de gel de película para la recogida de biopartículas. (A) La cubierta protectora posterior del blanco se retira con unas pinzas estériles de la pieza de gel de película para exponer el adhesivo. El gel de película luego se adhiere a un portaobjetos de vidrio con una presión firme. (B) Cuando la muestra de gel película está listo para ser utilizado para la recolección de biopartículas, la película protectora transparente superior se retira usando pinzas estériles. Figura 2: colección biopartículas utilizando gel-películas de diversos sustratos. Las diapositivas gel de película puede ser utilizado para recoger biopartículas de una variedad de superficies. El gel de película se coloca en contacto directo con el objeto o superficie de interés. Una suave presión se aplica con el fin de transferir biopartículas sobre la superficie de gel de la película. Colección de biopartículas de (A) los artículos usados ​​de vestir (cuello del abrigo), (B) Objetos tocó (viajes taza de café), y (C) de la piel humana directa (muñeca masculina) se muestran. Figura 3:. Biopartículas en un artículo de la ropa desgastada (en el interior de las bragas de la pierna) biopartículas se transfieren a gel de película a través del contacto directo con la superficie del objeto. Biopartículas se pueden encontrar como "matas" o biopartículas individuales / individuales (indicados con flechas rojas). <img alt = "Figura 4" src = "/ files / ftp_upload / 52612 / 52612fig4.jpg" /> Figura 4:. Tinción opcional de biopartículas en las diapositivas de gel de capa Para una mejor visualización de biopartículas, muestras de gel de capa se pueden teñir con colorante azul tripán. Toda la superficie de gel de película está cubierto por azul de tripano (A). Después de 1-2 minutos de la tinción, la corredera se inclina suavemente para permitir que el exceso de colorante para funcionar fuera de la diapositiva (B). Inundaciones suave con agua estéril (C) se puede utilizar para eliminar el exceso de tinción. Después de la diapositiva se seca el aire, la diapositiva se puede ver bajo el microscopio para asegurar tinción apropiada (D, E). Nota:. No todas las biopartículas aparecerán manchado (es decir, de color azul) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. oad / 52612 / 52612fig5.jpg "/> Figura 5: recogida y análisis de biopartículas. (A) Una pequeña cantidad (o "bola") de cinta de soldadura de onda soluble en agua ("adhesivo") se recoge en la punta de una aguja de tungsteno por raspado suave. (B) El adhesivo es entonces tocó a la de gel superficie de la película con el fin de recoger las biopartículas de interés. Biopartículas individuales o múltiples pueden ser recogidos con una bola de adhesivo individual. (C) Una vez se han recogido las biopartículas deseadas, la punta de la aguja se coloca en mezcla de amplificación en un tubo de PCR de 0,2 ml. La aguja se mantiene en el líquido hasta que se disuelva y se observa la liberación de biopartículas en la solución. Todos los pasos en el proceso de recolección se realizan y se observan bajo el microscopio para asegurar el cobro biopartícula exitosa y la transferencia. Por favor, haga clic aquí para ver un larger versión de esta figura. Figura 6:. Biopartículas individuales en una muestra de cuello de la camisa biopartículas se recupera usando gel de película desde el interior de un cuello de la camisa usada por un donante masculino. Los biopartículas se tiñeron utilizando azul tripán e imágenes de veinte biopartículas individuales diferentes identificados en la muestra se muestran. En cada imagen, la biopartículas que se recogió se rodeó (círculos rojos indicando biopartículas en que se recuperó un perfil; círculos negros indican biopartículas en el que no se recuperó un perfil). La recuperación alelo ciento (número de alelos observados de un máximo de 30) se muestra por encima de la imagen de biopartículas de la que se recuperó un perfil. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: agrupados biopartículas en una muestra cuello de la camisa biopartículas se recupera usando gel de película desde el interior de un cuello de la camisa usada por un donante masculino.. Los biopartículas se tiñeron utilizando azul tripán e imágenes de veinte biopartículas agrupadas diferentes identificados en la muestra se muestran. En cada imagen, la biopartículas que se recogió con un círculo (círculos rojos indican biopartículas en el que se recuperó un perfil; círculos negros indican biopartículas en el que un perfil no se recuperó La recuperación alelo ciento (número de alelos observados de un máximo de 30). se muestra para cada biopartícula de la que se recuperó un perfil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.wipáginas delgada = "always"> Figura 8: Perfil autosómica STR obtenido a partir de una sola biopartículas de un cuello de la camisa masculina Un perfil de STR ​​autosómica se obtuvo de un solo biopartículas (mostrado a la izquierda) usando los 5 l de lisis directa / reacción de amplificación.. La precisión de este perfil se determinó por comparación con una muestra de referencia de los donantes. Quince autosómica loci STR y amelogenina (determinación del sexo) son co-amplificado en una sola reacción y se separó por electroforesis capilar. Los resultados se muestran aquí como un electroferograma. Número de alelos son designación debajo de cada pico en cada locus. El eje x representa el tamaño del fragmento (pares de bases, pb) y el eje Y representa la intensidad de la señal (RFU unidades de fluorescencia relativa; prevista en cada número alelo correspondiente). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra. Figura 9: Perfil autosómica STR obtenido de una biopartícula agrupada de un cuello de la camisa masculina Un perfil de STR ​​autosómica se obtuvo de una biopartícula agrupada (mostrado a la izquierda) usando los 5 l de lisis directa / reacción de amplificación.. La precisión de este perfil se determinó por comparación con una muestra de referencia de los donantes. Quince autosómica loci STR y amelogenina (determinación del sexo) son co-amplificado en una sola reacción y se separó por electroforesis capilar. Los resultados se muestran aquí como un electroferograma. Número de alelos son designación debajo de cada pico en cada locus. El eje x representa el tamaño del fragmento (pares de bases, pb) y el eje Y representa la intensidad de señal (RFU unidades de fluorescencia relativa; prevista en cada número de alelo correspondiente).pg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 10:. Ejemplo de un fracaso en la obtención de un perfil STR autosómicos obtenida de un biopartícula recogido El biopartícula individuo se muestra a la izquierda se recogió una muestra de gel de capa cuello de la camisa. Como se puede observar a partir del perfil STR resultante (mostrado a la derecha), se obtuvo un solo alelo (de 30 posible). Número de alelos son designación debajo de cada pico en cada locus. El eje x representa el tamaño del fragmento (pares de bases, pb) y el eje Y representa la intensidad de la señal (RFU unidades de fluorescencia relativa; prevista en cada número alelo correspondiente). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aquí hemos descrito métodos para la recolección y análisis de genética mejorada de biopartículas recuperados de las pruebas de ADN toque. El enfoque desarrollado involucra lo siguiente: 1) la recolección de material biológico (es decir, las biopartículas) a través de gel de capa de objetos tocados y superficies, prendas gastadas o la piel humana directa, 2) el examen microscópico del material biológico recuperado para asegurar la recolección de potencial material humano biológica, y 3) la micromanipulación de biopartículas único o pocos utilizando un adhesivo soluble en agua, y 4) perfiles de ADN autosómico-STR de las biopartículas recogieron usando un microtomo (5 l) de una sola etapa de lisis / reacción de amplificación. El uso de una reacción de tubo cerrado de un solo paso reduce el potencial de contaminación de la muestra y la pérdida de manipulaciones de muestra adicionales o transferencia a otros tubos de reacción. El solo paso mejorado microvolumen (5 l) lisis / reacciones de amplificación STR permite la recuperación de la plena o probative STR perfiles del donante de biopartículas único o pocos. Este enfoque fue desarrollado para obtener perfiles individuales STR fuente de contacto pruebas de ADN de una o varias fuentes (por ejemplo, artículos usados ​​de vestir y otros artículos para el hogar, tocado / objetos y superficies manejadas, mezclas de piel / piel). Se ha utilizado con éxito para la detección del donante masculino en muestras físicas simuladas mezcla asalto.

Este enfoque podría evaluarse aún más en escenarios adicionales de mezcla de fluidos corporales / tejido tales como víctima rascándose la / su agresor, en la que sólo unos pocos biopartículas del agresor estarían presentes entre una abrumadora cantidad de material biológico de la víctima. Además, ya que este enfoque desarrollado en el estudio actual permite el análisis a nivel biopartículas única, que podría ser utilizado para obtener una mejor comprensión de la naturaleza y el alcance de transferencia secundaria 14-19, en el que un intermediario transfiere un perfil de ADN en un surface, objeto o persona a otro objeto de superficie o de la persona 20. Un enfoque ciego-hisopado para el análisis de transferencia secundaria puede fallar para identificar trazas de material desde el donante secundaria. El enfoque desarrollado aquí permite el análisis de biopartículas único o pocos y por lo tanto los resultados no son confundidos por la presencia de una cantidad abrumadora de material biológico del donante primario. Las metodologías desarrolladas en este trabajo también puede tener implicaciones para el análisis de material biológico rastro en casos de agresión sexual como las relacionadas con la penetración digital de la vagina donde la identificación positiva de pequeñas cantidades de células de la piel del agresor podría ser crucial para establecer que el contacto sexual ocurrido.

Mientras que la colección de biopartículas de muestra de gel de película no implica manipulaciones difíciles y complejos, hay pasos críticos en este procedimiento que deban llevarse a cabo con gran cuidado para asegurar el Doccessful transferencia de biopartículas al recipiente de reacción aguas abajo. La colección de biopartículas con el adhesivo soluble en agua debe ser visto microscópicamente (es decir, estereomicroscopio a gran aumento (~ 200-300X) para asegurar que se recogen sólo las biopartículas de interés. Dependiendo del tamaño de la "bola" adhesivo utilizado, hay es el potencial para recoger el material circundante adicional que puede incluir tanto material biológico y no biológico (por ejemplo, fibras, otros residuos). La colección de biopartículas adicionales no deseadas puede resultar en la recuperación de los perfiles de ADN mezclados. La colección de material no biológico puede introducir inhibidores en la lisis micro-volumen / reacciones Str. Si varios biopartículas se recogen con el mismo adhesivo "bola", hay un potencial de biopartículas recogidos previamente a convertirse unattached del adhesivo. Esto no se observa con frecuencia, pero puede ocurrir cuando un mayor número de bioparticlES son recogidos (por ejemplo, más de 50) con una sola "bola" adhesivo. Si un gran número de biopartículas están dirigidos, se recomienda que se realizan varias colecciones de menos biopartículas pero todos transferidos en el mismo tubo de 0,2 ml. Una vez que se han recogido biopartículas, se debe tener cuidado durante la retirada de la corredera gel de película de la platina del microscopio y la colocación del tubo de 0,2 ml para que la punta de la aguja no se perturba. Durante la colocación de la punta de la aguja en la mezcla de amplificación en la parte inferior del tubo de 0,2 ml, la punta de la aguja no debe hacer contacto con los lados del tubo con el fin de evitar la pérdida de material en los lados del tubo. Mientras que la solubilización del adhesivo es típicamente rápida (~ 30 seg o menos dependiendo del tamaño de la "bola" adhesivo) y puede vigilarse durante el examen microscópico, la punta de la aguja debe ser retirado lentamente de la mezcla de amplificación para asegurar que completa solubilizacióndel adhesivo que se ha logrado. Si el adhesivo no se ha disuelto completamente, la aguja puede ser devuelto al líquido para permitir la disolución completa.

Los protocolos descritos aquí se han optimizado para su uso con biopartículas y células humanas de evidencia biológica forense. El tampón de lisis seleccionado es compatible con el kit de amplificación de ADN-STR seleccionado. Si bien puede haber tampones de lisis alternativas adecuadas, su eficiencia en términos de la lisis celular y la compatibilidad con los análisis de aguas abajo debe ser verificada por el usuario. Además, el número de kit de amplificación de STR y ciclo de amplificación se describe en este protocolo ha sido optimizado para su uso con biopartículas único o pocos. Se seleccionó un kit de amplificación de STR próxima generación con informado de una mayor robustez y la sensibilidad y se ha demostrado para dar lugar a la recuperación de perfiles STR de alta calidad de biopartículas único o pocos. Mientras que muchos otros juegos de STR, con diferentes amplifi recomendadonúmero de ciclos de cationes, están disponibles, pueden no poseer la sensibilidad adecuada y por lo tanto tendrían que ser evaluados adecuadamente antes de su uso en estos protocolos.

A pesar de la utilización con éxito de los métodos descritos para los perfiles STR recuperación de biopartículas único o pocos, la tasa de éxito de la recuperación de perfil no será 100%. Por lo tanto, para algunas muestras se pueden observar un perfil de ADN parcial limitada o sin perfil. Esto no se puede evitar debido a la incapacidad para identificar de manera concluyente visualmente la mayoría de biopartículas como material celular, el potencial estado de degradación del material nuclear en las biopartículas o pérdida de material de muestra desde el adhesivo recogidos antes de la transferencia al recipiente de reacción. Por lo tanto, no se recomienda el análisis de una sola muestra biopartícula para cada elemento de ADN toque. Con frecuencia recopilamos 20 conjuntos de muestras de una muestra individual en gel de película y recopilaremos conjuntos de muestras adicionales según sea necesario si no se obtiene un perfil STR adecuado. Tél única limitación para las colecciones es la cantidad de material biológico presente en la muestra de gel de película (y probablemente el coste de análisis, aunque las reacciones microvolumen proporcionan la oportunidad de recoger muestras adicionales para un coste similar o inferior como un volumen de reacción estándar único ( por ejemplo, 25 l).

Los métodos de perfiles de ADN desarrollados describen aquí proporcionan un enfoque basado molecular para la caracterización, análisis e interpretación de material biológico rastro recuperado de muestras de ADN de toque. Sin embargo, no hay información genética adicional que puede obtenerse a partir de las biopartículas recuperados, además de la determinación del donante (es decir, el perfil de STR) del donante del material biológico. La fuente de tejido o fluido corporal de origen (por ejemplo, la piel frente a la saliva) puede proporcionar información contextual crucial para una investigación criminal. Sin tal determinación, la ambigüedad de la fuente de tejido de origen puede ser explitada como las circunstancias alternativas del delito (por ejemplo, ¿cómo puede haber sido depositado el fluido corporal) podría ser sugerido. Los protocolos de recogida de biopartículas y aislamiento descritos aquí se podrían utilizar para recopilar biopartículas u otras células (por ejemplo, bucal, vaginal) para uso en una identificación de la fuente de tejido (mRNA de perfiles 21-30) estrategia que implica micro-volumen de transcripción inversa (RT) y reacciones de amplificación. Con una optimización adicional también puede ser posible desarrollar un / estrategia de co-aislamiento de ARN de ADN para permitir la identificación del tipo de célula (ARN) y de perfiles STR de la misma muestra, incluyendo biopartículas de pruebas de ADN táctil.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would also like to thank all participants who donated samples for this work. This work was funded by the Office of Justice Program, National Institute of Justice, Department of Justice under award number 2010-DN-BX-K139. The funding agencies had no involvement in the study design, in collection, analysis and interpretation of data, or in the writing of the report. Points of view in this document are those of the authors and do not necessarily represent the official positions of the U.S. Department of Justice.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile USA Scientific 1615-5510 numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile
0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural Phenix Research MPX-200F or equivalent
Kimwipes Fisher Scientific 06-666 and/or 06-666-11C
Alcohol prep pads Fisher Scientific 06-669-62 alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads
Sterile water 18.2 mega-ohm, autoclaved
Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1mm Fisher Scientific 12-544-3 alternative brands or sizes are acceptable
Disposable transfer pipet Fisher Scientific 13-711-9D alternatives are acceptable
Trypan blue solution Sigma T8154
Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL various
Sterile, aerosol-resistant pipet tips various
Mini-centrifuge various
Stereomicroscope Leica M205C others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X
GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) Life Technologies N8050200 or 4314878 other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified
3130 Genetic Analyzer Life Technologies 3130-01 Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies)
GeneMapper software Life Technologies various Various versions of the software are available and can be used
WF Gel-Film , x8 retention level Gel-Pak WF-40-x8-A 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications
Double sided tape various
Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" McCrone Microscopes and Accessories 370-2 or equivalent
Tungsten needle with holder McCrone Microscopes and Accessories 106
3M  water soluble wave solder tape, 5414 transparent Allied Electronics 70113977
Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) VWR 95043-992 Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer – blue, 1 mL forensicGEM. 
STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit Life Technologies 4427368 Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection. 
AmpliTaq Gold DNA polymerase Life Technologies N808-0245
HiDi formamide Life Technologies 4311320
GeneScan 500 LIZ size standard Life Technologies 4322682
96 well optical reaction plates Life Technologies N8010560
Plate septa, 96 well Life Technologies 4315933
Performance-optimized polymer, POP-7 Life Technologies 4363785 Alternatives such as POP-4 are acceptable
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References

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Farash, K., Hanson, E. K., Ballantyne, J. Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic ‘Touch DNA’ Evidence. J. Vis. Exp. (97), e52612, doi:10.3791/52612 (2015).
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