Erweiterte Genetische Analyse der Einzelmenschen Biopartikeln von Simplified Mikromanipulation von Forensic 'Touch DNA' Evidence Recovered
Summary
Hier beschreiben wir eine optimierte und effiziente Entfernung Strategie für die Sammlung von in der heutigen Bio-Partikel 'berühren DNA' Proben, zusammen mit einer verbesserten Amplifikationsprotokoll mit einem einstufigen 5 ul Mikrovolumen Lyse / STR Verstärkung, um die Erholung der erlauben Short Tandem Repeat (STR) Profile der Bio-Korn Spender (n).
Abstract
DNA-Profile können aus 'touch DNA "Beweise, die mikroskopische Spuren von menschlichem biologischem Material besteht, erhalten werden. Aktuelle Verfahren zur Rückgewinnung von Spuren DNA beschäftigen Wattestäbchen oder Klebeband einen Bereich von Interesse zu probieren. Allerdings wird eine solche "Blind swabbing Ansatz zusammen Probe Zellmaterial aus den verschiedenen Individuen, auch wenn der Individuen Zellen werden in geographisch unterschiedlichen Orten auf dem Artikel entfernt. Somit können einige der DNA-Mischungen in Kontakt DNA Proben angetroffen werden künstlich durch das Einstreich selbst erzeugt. In einigen Fällen kann ein Opfer DNA in erhebliche Überschreitung gefunden werden damit alle potenziellen Täters DNA Maskierung.
Um die Herausforderungen, die mit Standard-Recovery-und Analyseverfahren zu umgehen, haben wir ein kostengünstiger, "intelligente Analyse 'Methode, die zu einer erhöhten genetischen Analyse von Touch-DNA-Beweise ergibt entwickelt. Wir beschreiben eine optimierte eind effiziente Mikromanipulation Recovery-Strategie für die Sammlung von DNA-Proben in Kontakt vorhanden bio-Partikel sowie eine verbesserte Verstärkung Strategie, die ein einstufiges 5 ul Mikrovolumen Lyse / STR Verstärkung, um die Erholung der STR-Profile aus dem Bio-Korn Spenders erlauben (e). Die Verwendung von einzelnen oder wenigen (dh "Klumpen") Biopartikeln Ergebnisse in der Fähigkeit, Hand-Profile zu erhalten. Diese Verfahren stellen alternative verbesserte Techniken zur Isolierung und Analyse einzelner Biopartikeln von forensischen Touch-DNA-Beweise. Während in jedem forensischen Untersuchung nicht notwendig ist, kann die Methode sehr vorteilhaft für die Gewinnung von einer Hand Täter DNA-Profil in Fällen körperlicher Gewalt (zB Strangulation), die nicht möglich sein kann mit Standard-Analyseverfahren sein. Zusätzlich sind die hier entwickelten Strategien bieten die Möglichkeit, genetische Information in der Einzelzellebene aus einer Vielzahl von o zu erhaltenther nicht-forensische Spuren biologischem Material.
Introduction
Touch-DNA ist eine Form der Spur biologischen Beweismaterial, das die direkte Übertragung von Zellmaterial ist (zB Schuppen Hautzellen) von einer Einzelperson zu einem Objekt oder einer anderen Person beim Körperkontakt 1. Die Fähigkeit, DNA-Profile aus einer Vielzahl von Objekten zu erhalten berührt (Dokumente, Bettwäsche, Schuhe, Waffen, Trinkbehälter, Stifte, Aktenkoffer Griffe) wurde in der Literatur 9.2 berichtet.
Ein kritischer Faktor bei der Analyse von DNA-Spuren Touch ist die erfolgreiche Wiederherstellung der biologischen Spurenmaterial vorhanden. Tippen Sie auf DNA-Spuren wird typischerweise durch Abtupfen der verdächtigten Bereich mit einem sterilen Wattestäbchen gesammelt (im Folgenden als "blind-Abstrich" bezeichnet). Mit diesem Ansatz wird die Art der gesammelten biologischen Materials nicht bekannt ist und Abtastung eines verallgemeinerten Bereich durchgeführt wird. Die Anwesenheit der Oberfläche Rillen oder Spalten kann die erfolgreiche Wiederherstellung der oft schon kleine Menge von Bi behinderngischen Material vorhanden. Zusätzlich wird ein "blind-Abstrich-Ansatz zwangsläufig Zusammenarbeit Probe Zellmaterial aus den verschiedenen Individuen, deren Zellen auf das Element vorhanden sind, auch wenn der Individuen Zellen werden in räumlich getrennten Stellen auf dem Objekt befindet. Die Erholung der beigemischten DNA-Profilen, die oft eine Herausforderung, besonders mit niedrigen template DNA-Proben zu lösen, wird häufig beobachtet, 8,10,11 und in vielen Fällen wird eine Folge Artefakt der swabbing Prozess selbst. Wenn nur eine kleine Menge an Material vorhanden war von einem der Spender kann Standard-Extraktion und Analyse-Techniken nicht, ein Profil aus der geringfügigen Beitrag zu erholen. Zusätzlich kann die Art der Tupfer oder ob es trocken oder nass verwendet (vorbefeuchteten mit sterilem Wasser) kann die Menge an biologischem Material, das gesammelt wird aufgrund von Unterschieden in Absorptionsfähigkeit und Adsorptionsfähigkeit und die Effizienz der Freisetzung des biologischen Materials 12 zu beeinflussen. Standard Extraktionsverfahren können in zusätzlichen Probenverlust aufgrund erforderlichen physikalischen Manipulationen der Probe oder Probentransferschritten führen.
Wie oben beschrieben, können einfache Einstreichtechniken für die Gewinnung von biologischem Material in den Verlust von Spurenmengen von biologischen Probe, sowie ein erhöhtes Auftreten von beigemischten Profile aufgrund eines Fehlers zu individuellen biologischen Komponenten zu trennen führen. Deshalb haben wir versucht, selektiver und effizienter Wiederherstellungsstrategien für die Sammlung von über berührte Objekte vorhanden zellulären Mikropartikeln zu entwickeln. Das entwickelte Strategie zur Analyse von biologischem Material durch Berührung DNA Beweis (hier bezeichnet als "Biopartikel" aufgrund der Tatsache, dass ein Kern ist nicht immer sichtbar, da ein Großteil der Zellen in der äußeren epidermalen Schicht der Haut tot oder sterbend sind Keratinozyten 13) beinhaltet die folgenden: 1) Sammlung von biologischem Material (dh Biopartikeln) über Gelfilmbildung from berührt Gegenständen und Flächen, verschlissene Kleidungsstücke oder direkte menschliche Haut, 2) mikroskopische Untersuchung des gewonnenen biologischen Material die Sammlung von möglichen menschlichen biologischen Materials zu gewährleisten, und 3) die Mikromanipulation einzelner oder weniger bio-Partikel mit einem wasserlöslichen Klebstoff und 4) autosomal DNA-STR Profilierung der gesammelten biologischen Partikeln mit einem Mikrovolumen (5 ul) einstufige Lyse / Amplifikationsreaktion.
Dieses Verfahren bietet zahlreiche Vorteile gegenüber traditionell verwendeten Analysemethoden. Rückgewinnung von Biopartikeln mit der Gel-Film ermöglicht eine mikroskopische Untersuchung des in der Probe vor der Analyse der biologischen Material vorhanden. Während ein Großteil der Biopartikel aus Touch DNA Beweis gewonnen möglicherweise nicht kernhaltige Zellen macht es schwierig, festzustellen, welche oder wie viele biologische Partikel sollten ausgewählt werden, die mikroskopische Untersuchung der Proben vor der Analyse bietet die Gelegenheit zu geben für kernhaltige Zellen zu suchen so maximizing die Wahrscheinlichkeit von DNA-Profil Erholung. Die Sammlung von Biopartikeln Verwendung wasserlöslicher Klebstoff unterstützten Mikromanipulation erlaubt die direkte Übertragung von gezielten Biopartikeln in Reaktionsgefäßen. Dieses Verfahren ist unter dem Mikroskop sichtbar gemacht, um eine erfolgreiche Übertragung des biologischen Materials zu gewährleisten. Das reduziert oder Mikrovolumen Reaktion erhöht die Empfindlichkeit bei gleichzeitiger Reduzierung der Kosten für die Analyse pro Probe. Dies ermöglicht die Analyse der erhöhten Anzahl von Proben aus einem einzelnen Stück von Beweisen. Durch den Bereich der genetischen Zustand der Bio-Partikel in Kontakt zu DNA-Spuren werden mehrere Stichproben aus einzelnen Positionen empfohlen.
Hier zeigen wir die erfolgreiche Anwendung der entwickelten Protokolle zur hochBeweis genetische Profile der Spender von biologischem Material in Kontakt zu DNA-Beweise erhalten. Die entwickelten Biopartikel Sammlung und DNA-Profiling Methoden bieten einen umfassenden "intelligenten" (dh spezifisch, messbar, attainable, realistische und zeitnahe) molekularen Ansatz für die Charakterisierung, Analyse und Interpretation der Spuren biologischem Material. Obwohl ursprünglich für die Anwendung auf die forensische Analyse von DNA-Spuren Touch entwickelt, können die hier entwickelten Strategien zu anderen Quellen von biologischem Material aufgetragen werden und bieten die Möglichkeit, individuelle Identifizierungsdaten auf Einzelzellebene zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir Methoden für die Sammlung und verbesserte genetische Analyse Biopartikeln von Touch DNA-Spuren wieder beschrieben. Der entwickelte Ansatz beinhaltet die folgenden: 1) Sammlung von biologischem Material (dh Biopartikeln) über Gel-Film aus berührte Gegenstände und Flächen, tragen Kleidungsstücke oder direkte menschliche Haut, 2) eine mikroskopische Untersuchung des gewonnenen biologischen Material zur Sammlung von potenziellen gewährleisten menschlichem biologischem Material, und 3) die Mikromanipulation einzelner oder weniger Biopartikel Verwendung eines wasserlöslichen Klebstoffs und 4) autosomal DNA-STR Profilierung der gesammelten Biopartikel mit einem Mikrovolumen (5 ul) einstufige Lyse / Amplifikationsreaktion. Die Verwendung von einem einstufigen geschlossenen Rohr Reaktion wird die Gefahr von Kontamination und Probenverlust weitere Probe Manipulationen oder Übertragung auf andere Reaktionsgefäße. Die verbesserte Ein-Schritt-Mikrovolumen (5 ul) Lyse / STR Amplifikationsreaktionen ermöglicht die Wiederherstellung der vollen oder probative STR Profile des Spenders einzelner oder weniger Biopartikel. Dieser Ansatz wurde entwickelt, um Hand STR Profile Single- und Multi-Source-Touch-DNA-Beweise (zB getragen Kleidungsstücken und andere Haushaltsgegenstände, berührt / behandelt Objekte und Oberflächen, Haut / Haut-Gemische) zu erhalten. Es hat erfolgreich für den Nachweis des männlichen Spenders in simulierten Körperverletzung Mischung Proben verwendet.
Diese Vorgehensweise könnte weiter in zusätzliche Körperflüssigkeit / Gewebemischung Szenarien wie ein Opfer kratzen seine / ihre Angreifer, in denen nur wenige Biopartikeln vom Angreifer würde bei einer überwältigenden Menge an biologischem Material von dem Opfer vorhanden sein ausgewertet werden. Zusätzlich wird, da dieser Ansatz in der aktuellen Studie entwickelt erlaubt die Analyse auf der Einzel Biopartikel Ebene könnte sie verwendet werden, um ein besseres Verständnis der Natur und das Ausmaß der sekundären Übertragungs 14-19, bei dem ein Zwischenträgt ein DNA-Profil auf einem surfa gewinnence, Objekt oder eine Person auf eine andere Oberfläche Objekt oder eine Person 20. Ein Blind swabbing Ansatz zur Analyse der sekundären Übertragung möglicherweise nicht Spuren von Material aus der Sekundär Spender zu identifizieren. Das hier entwickelte Ansatz ermöglicht die Analyse einzelner oder weniger Biopartikel und somit werden die Ergebnisse nicht durch die Anwesenheit von einer überwältigenden Menge an biologischem Material von der primären Donor verwechselt. Die in dieser Arbeit entwickelte können auch Auswirkungen für die Analyse von Spuren biologisches Material in Fällen sexueller Gewalt Methoden wie diejenigen, die digitale Penetration der Vagina, wo positive Identifizierung von Spuren von Hautzellen vom Täter könnte ausschlaggebend sein, dass sexuelle Kontakte zu knüpfen auftrat.
Während die Sammlung von Biopartikeln von Gel-Folienprobe wird schwieriger und komplexer Manipulationen nicht um, gibt es kritische Schritte in diesem Verfahren, die mit großer Sorgfalt, um die so sicher, durchgeführt werden müssenccessful Übertragung Biopartikeln zum nachgeschalteten Reaktionsgefäß. Die Sammlung von Biopartikeln mit dem wasserlöslichen Klebstoff muss mikroskopisch betrachtet werden (dh Stereomikroskop bei hoher Vergrößerung (~ 200-300X), um sicherzustellen, dass nur die Biopartikeln von Interesse gesammelt werden. Abhängig von der Größe des Klebers "Ball" verwendet wird, ist das Potenzial, um zusätzliche Umgebungsmaterial, das sowohl biologischen und nicht-biologischen Material (zB Fasern, andere Fremdkörper) enthalten kann, zu sammeln. Die Sammlung kann unbeabsichtigte zusätzliche Biopartikeln bei der Verwertung von beigemischten DNA-Profilen führen. Die Sammlung von nicht-biologischem Material Inhibitoren können in den Mikrovolumen Lyse einzuführen / STR Reaktionen. Wenn mehrere Biopartikel werden mit dem gleichen Klebstoff "Kugel" gesammelt werden, gibt es ein Potential für die zuvor gesammelte Biopartikel zu ungebunden vom Klebstoff zu werden. Dies ist nicht häufig beobachtet, können aber auftreten, wenn eine größere Anzahl von bioparticles werden gesammelt (zum Beispiel mehr als 50) mit einem einzigen Klebstoff "Ball". Wenn eine große Anzahl von Biopartikeln sind gezielte, wird empfohlen, dass mehrere Sammlungen von weniger Biopartikel gemacht werden, aber alle in den gleichen 0,2 ml Röhrchen überführt. Sobald Biopartikel gesammelt wurden, muß Sorgfalt während der Entfernung der Gelfilmbildung Folie aus der Objekttisch und der Platzierung der 0,2-ml-Röhrchen, so dass die Spitze der Nadel nicht gestört wird genommen werden. Während der Platzierung der Spitze der Nadel in das Amplifikationsgemisch am Boden der 0,2 ml-Röhrchen, sollte die Spitze der Nadel nicht in Kontakt mit den Seiten der Röhre zu machen, um den Verlust von Material an den Seiten der Röhre zu vermeiden. Während der Solubilisierung des Klebstoffs liegt typischerweise schnell (~ 30 s oder weniger in Abhängigkeit von der Größe der Klebe "Kugel") und kann während der mikroskopischen Prüfung geprüft wird, sollte die Spitze der Nadel langsam von der Amplifikationsgemisch entfernt werden, um sicherzustellen, daß eine vollständige Solubilisierungdes Klebstoffes erreicht wurde. Wenn der Klebstoff noch nicht vollständig gelöst ist, kann die Nadel in die Flüssigkeit zurückgeführt werden, um eine vollständige Auflösung zu ermöglichen.
Die hier beschriebenen Protokolle wurden für die Verwendung mit Biopartikeln und menschlichen Zellen aus forensischen biologischen Spuren optimiert. Der Lysepuffer ausgewählt ist mit der ausgewählten DNA-STR Amplifikationskit kompatibel. Zwar gibt es geeignete Alternative Lysepuffern zu können, muss ihre Effizienz im Hinblick auf die Zell-Lyse und die Kompatibilität mit Downstream-Analyse vom Anwender überprüft werden. Darüber hinaus haben die in diesem Protokoll beschriebenen STR Amplifikationskit und Amplifikationszyklus Nummer für die Verwendung mit einzelnen oder wenigen Biopartikeln optimiert. Eine neue Generation STR Amplification Kit mit berichteten erhöhte Robustheit und Sensitivität ausgewählt und wurde gezeigt, dass bei der Rückgewinnung von hochwertigen STR Profile einzelner oder weniger Biopartikeln führen. Während zahlreiche andere STR-Kits, mit unterschiedlichen empfohlen amplifiKation Zyklenzahlen, zur Verfügung stehen, können sie nicht geeignet Empfindlichkeit besitzen und deshalb müssen richtig vor der Verwendung in dieser Protokolle ausgewertet werden.
Trotz der erfolgreichen Anwendung der beschriebenen Methoden für die Wiederherstellung STR-Profile von einzelnen oder wenigen Biopartikeln, wird die Erfolgsrate der Profilrückgewinnung nicht 100% sein. Daher wird für einige Proben eine begrenzte DNA-Teilprofil oder kein Profil beobachtet werden. Dies kann wegen der Unfähigkeit, abschließend visuell identifizieren meisten Biopartikeln wie Zellmaterial vermieden werden, wird das Potential beeinträchtigten Zustand des Kernmaterials in den gesammelten Biopartikel oder Verlust von Probenmaterial aus dem Klebstoff vor der Übertragung in das Reaktionsgefäß. Daher ist die Analyse eines einzelnen Biopartikel Probe für jede Note DNA Artikel nicht empfohlen. Wir sammeln häufig 20 Sample-Sets von einem einzelnen Gel-Folienprobe und zusätzliche Sample-Sets zu sammeln, wie gebraucht, wenn ein geeignetes STR-Profil wird nicht erhalten. Ter einzige Einschränkung für die Sammlung ist die Menge an biologischem Material auf dem Gel-Folienprobe (und wahrscheinlich die Kosten für die Analyse vorhanden, obwohl die Mikrovolumen Reaktionen bieten die Möglichkeit, zusätzliche Proben für eine ähnliche oder geringere Kosten als ein einziges Standard-Reaktionsvolumen zu sammeln ( beispielsweise 25 & mgr; l).
Die entwickelten DNA-Profiling Methoden beschreiben hier einen molekularen Ansatz für die Charakterisierung, Analyse und Interpretation der Spuren biologisches Material von Touch-DNA-Proben gewonnen. Allerdings gibt es zusätzliche genetische Information, die aus den gewonnenen Biopartikel neben Bestimmung der Spender (dh STR Profil) des Spenders von dem biologischen Material gewonnen werden kann. Das Gewebe oder Körperflüssigkeit Ursprungsquelle (zB der Haut gegenüber Speichel) können vorsehen, wichtige Kontextinformationen zu einer strafrechtlichen Untersuchung. Ohne eine solche Bestimmung kann die Mehrdeutigkeit der Gewebequelle Herkunfts Explo werdenITED als alternative Umstände des Verbrechens (zB, wie der Körper Flüssigkeit abgelagert worden sein) könnte vorgeschlagen werden. Die hier beschriebenen Biopartikel Sammlung und Trennung Protokolle könnten verwendet werden, um Biopartikel oder anderen Zellen (zB bukkal, vaginal) zur Verwendung in einem Gewebequellenidentifikation (mRNA Profilierungs 21-30) Strategie, die Mikrovolumen reverse Transkription (RT) umfasst sammeln und Amplifikationsreaktionen. Mit weiteren Optimierung kann es auch möglich sein, ein DNA / RNA co-Isolationsstrategie, um Zelltyp-Erkennung (RNA) und STR Profilierung aus der gleichen Probe, einschließlich Biopartikel von Berührungs DNA Nachweis gestatten zu entwickeln.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would also like to thank all participants who donated samples for this work. This work was funded by the Office of Justice Program, National Institute of Justice, Department of Justice under award number 2010-DN-BX-K139. The funding agencies had no involvement in the study design, in collection, analysis and interpretation of data, or in the writing of the report. Points of view in this document are those of the authors and do not necessarily represent the official positions of the U.S. Department of Justice.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile |
| 0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
| Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
| Sterile water | 18.2 mega-ohm, autoclaved | ||
| Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
| Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL | various | ||
| Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
| Mini-centrifuge | various | ||
| Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
| GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
| GeneMapper software | Life Technologies | various | Various versions of the software are available and can be used |
| WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
| Double sided tape | various | ||
| Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
| Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
| 3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
| Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer – blue, 1 mL forensicGEM. |
| STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection. |
| AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
| HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
| 96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
| Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
| Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |
References
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