Maggiore analisi genetica di singole bioparticelle umani recuperati da semplificato Micromanipolazione da Forensic Evidence 'tocco DNA'

Immagini rappresentative della bioparticelle individuali e ragruppato che sono stati recuperati da un colletto della camicia (100% poliestere) indossato da un donatore maschio sono mostrati in figura 6 (individuali bioparticelle) e la figura 7 (bioparticelle ragruppato). I bioparticelle sono stati recuperati dal colletto della camicia utilizzando il protocollo descritto qui: trasferimento di bioparticelle dal colletto della camicia di gel-pellicola attraverso il contatto diretto, la colorazione delle bioparticelle recuperati con trypan blu, raccolta di campioni bioparticle utilizzando un ago di tungsteno e adesivo solubile in acqua e analisi STR utilizzando l'amplificazione 5 microlitri micro-volumi lisi / STR. Figure 6 e 7 rappresentano un campionamento tipica di bioparticelle che sarebbero analizzati da un elemento tocco DNA individuale (20 bioparticelle singoli / singole e 20 bioparticelle aggregata). Il bioparticle (s) raccolti in ogni immagine sono etichettati con lunghezza e larghezza misure (in micron). La percentage di alleli STR recuperati da ciascuno dei bioparticle (s) raccolti viene fornito su ogni singola immagine per dimostrare i gradi variabili di successo che ci si può aspettare di ottenere dal bioparticelle con questo tipo di prove. I bioparticelle recuperati da campioni di DNA tocco sono ampiamente morti o morenti cheratinociti e quindi un profilo STR probatorio non è ottenuta da ciascuna bioparticle raccolto, come visibile nelle figure 6 e 7. Per questo esempio colletto della camicia, profili STR sono stati ottenuti da 14/20 (70%) dei singoli bioparticelle e 15/20 (75%) hanno ragruppato bioparticelle. Tuttavia, ognuno dei profili recuperati gamme di valore probatorio: 3-97% di recupero allele per singoli profili bioparticelle e 3-100% di recupero allele per i profili bioparticle ragruppato. A causa della variabilità dei tassi di successo, si raccomanda la raccolta di numerosi bioparticelle da ogni elemento del DNA tocco. Ciò garantisce una migliore possibilità di ottenere una elevata probative profilo STR. Il profilo STR ottenuti da uno dei singoli campioni bioparticle dal colletto della camicia è mostrata in Figura 8 (il bioparticle da cui il profilo origine viene mostrato a sinistra). Quasi un profilo STR completo (28 su 30 alleli, un locus abbandonano, la precisione del profilo ottenuto verificata rispetto ad un profilo di riferimento) è stato ottenuto da questo individuo bioparticle. Il profilo ottenuto è di alta qualità con ragionevolmente equilibrate picco altezze inter-locus e non allelica abbandono. Allelic drop out e sbilanciati manufatti altezza di picco sono entrambi spesso osservata con campioni di DNA bassa del modello. Il profilo STR ottenuti da uno dei campioni bioparticle ragruppato dal colletto della camicia è mostrato nella Figura 9. Un profilo completo STR (30/30 alleli, la precisione del profilo ottenuto verificata rispetto ad un profilo di riferimento) è stato ottenuto. Come accennato in precedenza, un profilo STR non viene recuperato da semprey bioparticle raccolto. Un esempio di insuccesso profili DNA di un singolo bioparticle (3% di recupero allele, 1/30 alleli) è mostrato in Figura 10 (bioparticle individuale). Mentre questo individuo bioparticle non ha avuto successo, molto probanti profili STR del donatore delle bioparticelle in questo campione sono stati ottenuti da altri bioparticelle recuperati dallo stesso campione. Ciò dimostra la necessità di eseguire più campionamenti singola cella / ciuffo dallo stesso oggetto. I metodi sviluppati "intelligenti" di analisi descritte qui per toccare la prova del DNA sono stati utilizzati con successo per recuperare i profili singola fonte probatori da sola e bioparticelle "ragruppato" provenienti da vari toccato oggetti e capi d'abbigliamento (ad esempio, sedie braccioli, ruote sterzanti auto, telefoni cellulari, tazze di caffè, sigarette, penne, magliette, pantaloncini e maglie). Tuttavia, soprattutto, questo approccio è stato utilizzato anche per la rilevazione e profilatura di maschio dOnor DNA (un'unica fonte) in campioni di miscela contatto / aggressione fisica simulati (ad esempio, autore afferrando il polso, il collo della vittima o di abbigliamento, o contatto con biancheria da letto della vittima, come in aggressioni sessuali). Figura 1: Preparazione di vetrini gel a film per la raccolta bioparticle. (A) Il coperchio di protezione posteriore bianco viene rimossa con pinzette sterili dal pezzo di gel-pellicola per esporre la parte adesiva. Il gel-pellicola viene quindi rispettato un vetrino da microscopio in vetro con una forte pressione. (B) Quando il campione di gel-film è pronto per essere utilizzato per la raccolta bioparticle, il top pellicola protettiva trasparente viene rimossa con pinzette sterili. Figura 2: raccolta Bioparticle utilizzando gelpellicola stretch da vari substrati. Le slitte gel a film può essere utilizzato per raccogliere bioparticelle da una varietà di superfici. Il gel-film è posto a diretto contatto con l'oggetto o la superficie di interesse. Leggera pressione viene applicata per trasferire bioparticelle sulla superficie del gel a film. Raccolta di bioparticelle da (A) articoli indossati abbigliamento (collare cappotto), (B) ha toccato oggetti (viaggi tazza di caffè), e (C) pelle umana diretta (polso maschile) sono mostrati. Figura 3:. Bioparticelle su un capo d'abbigliamento usurato (all'interno pantalone) bioparticelle vengono trasferiti al gel pellicola attraverso il contatto diretto con la superficie dell'oggetto. Bioparticelle si trovano come "grumi" o individuali bioparticelle singoli / (indicati dalle frecce rosse). <img alt = "Figura 4" src = "/ files / ftp_upload / 52612 / 52612fig4.jpg" /> Figura 4:. Colorazione facoltativa del bioparticelle sui vetrini gel a film Per una migliore visualizzazione dei bioparticelle, campioni di gel a film possono essere colorati con trypan colorazione blu. L'intera superficie di gel-film è coperto da trypan blu (A). Dopo 1-2 min di colorazione, la slitta è inclinato leggermente per consentire eccesso di colorante di tirare la slitta (B). Gentle allagamento con acqua sterile (C) può essere utilizzata per rimuovere l'eccesso di colorante. Dopo la slitta viene essiccato, la slitta può essere osservato al microscopio per garantire la corretta colorazione (D, E). Nota:. Non tutti bioparticelle appariranno macchiato (cioè, di colore blu) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. OAD / 52612 / 52612fig5.jpg "/> Figura 5: raccolta e analisi Bioparticle. (A) Una piccola quantità (o "pallone") di nastro onda saldatura idrosolubile ("collante") viene raccolto sulla punta di un ago di tungsteno delicatamente raschiatura. (B) L'adesivo viene toccata al gel- superficie della pellicola per raccogliere le bioparticelle di interesse. Bioparticelle singole o multiple possono essere raccolti con una singola sfera adesivo. (C) Una volta che i bioparticelle desiderati sono stati raccolti, la punta dell'ago viene inserita nella miscela di amplificazione in una provetta 0,2 ml PCR. L'ago viene tenuto nel liquido fino a completa dissoluzione e il rilascio di bioparticelle in soluzione viene osservata. Tutte le fasi del processo di raccolta vengono eseguiti e visualizzati sotto il microscopio per assicurare la raccolta bioparticle di successo e il trasferimento. Clicca qui per visualizzare un larversione ger di questa figura. Figura 6:. Bioparticelle individuali in un campione colletto bioparticelle stati recuperati usando gel pellicola dall'interno di un collare camicia indossata da un donatore maschile. I bioparticelle erano macchiati con trypan blu e le immagini di venti diversi bioparticelle singoli individuati nel campione sono mostrati. In ogni immagine, il bioparticle che è stato raccolto è cerchiata (cerchi rossi indicano bioparticelle in cui è stato recuperato un profilo, cerchi neri indicano bioparticelle in cui un profilo non è stato recuperato). La percentuale di recupero allele (numero di alleli osservati su un massimo di 30), viene visualizzato sopra l'immagine di bioparticle da cui profilo è stato recuperato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 7: clumped bioparticelle in un campione colletto bioparticelle stati recuperati usando gel pellicola dall'interno di un collare camicia indossata da un donatore maschile.. I bioparticelle erano macchiati con trypan blu e le immagini di venti diversi bioparticelle aggregata individuati nel campione sono mostrati. In ogni immagine, il bioparticle che è stato raccolto è cerchiata (cerchi rossi indicano bioparticelle in cui è stato recuperato un profilo, cerchi neri indicano bioparticelle in cui un profilo non è stato recuperato la percentuale di recupero allele (numero di alleli osservati su un massimo di 30). è indicato per ogni bioparticle da cui profilo è stato recuperato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Figura 8: profilo autosomica STR ottenuto da un singolo bioparticle da un colletto della camicia maschile Un profilo autosomica STR è stato ottenuto da un unico bioparticle (mostrato a sinistra) con i 5 ml di lisi diretta / reazione di amplificazione.. La precisione di questo profilo è stato determinato rispetto ad un campione di riferimento donatore. Quindici autosomica STR loci e amelogenina (determinazione del sesso) sono co-amplificati in una singola reazione e separati mediante elettroforesi capillare. I risultati vengono visualizzati qui come elettroferogramma. Numeri alleliche sono designazione sotto ogni picco ad ogni locus. L'asse x rappresenta la dimensione del frammento (paia di basi, bp) e Y rappresenta intensità del segnale (RFU unità relativa a fluorescenza, a condizione in ogni numero corrispondente allele). Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura. Figura 9: profilo autosomica STR ottenuto da un bioparticle clumped da un colletto della camicia maschile Un profilo autosomica STR è stato ottenuto da un bioparticle clumped (mostrato a sinistra) con i 5 ml di lisi diretta / reazione di amplificazione.. La precisione di questo profilo è stato determinato rispetto ad un campione di riferimento donatore. Quindici autosomica STR loci e amelogenina (determinazione del sesso) sono co-amplificati in una singola reazione e separati mediante elettroforesi capillare. I risultati vengono visualizzati qui come elettroferogramma. Numeri alleliche sono designazione sotto ogni picco ad ogni locus. L'asse x rappresenta la dimensione del frammento (paia di basi, bp) e Y rappresenta l'intensità del segnale (RFU unità relativa a fluorescenza, a condizione in ogni numero corrispondente allele).pg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 10:. Esempio di un fallimento per ottenere un profilo autosomica STR ottenuto da un bioparticle raccolti Il bioparticle individuale mostrato a sinistra è stato raccolto da un campione di gel-pellicola colletto della camicia. Come si può vedere dal profilo STR risultante (mostrato a destra), è stato ottenuto un solo allele (su 30 possibili). Numeri alleliche sono designazione sotto ogni picco ad ogni locus. L'asse x rappresenta la dimensione del frammento (paia di basi, bp) e Y rappresenta l'intensità del segnale (RFU unità relativa a fluorescenza, a condizione in ogni numero corrispondente allele). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.