A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.
Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.
בשנים האחרונות, ההבנה של נוירון ותפקוד מעגל העצבי שלנו כבר מהפכה ידי מספר כלים optogenetic השולטים רגישות עצבית. כלי אחד כזה הוא ערוץ קטיון מופעל אור, channelrhodopsin-2 (ChR2): תאי עצב המבטאים פוטנציאל פעולת אש ChR2 בתגובה לגירוי אור 1-3. מכיוון שתאי עצב אינם בדרך כלל רגישים לאור, יכולת המופלאה זה פותחת אפיקים חדשים לשליטה של זמן ומרחב המדויק של הפעילות של אוכלוסיות גנטית מוגדרות של נוירונים 4 והואצה מחקרים של תפקוד המוח מאוד. ChR2 הוחל על תא גזע מחקר למטרות שונות, ממעקב אחר ההתפתחות עצבית 5 להסדרת פעילות של רשתות עצביות 6.
כאן השתמשנו ChR2 להגדיל את התועלת של מערכת שיתוף תרבות עצבית. מערכות שיתוף התרבות לאפשר ההערכה של יחסי גומלין בין תאים מסוגים שונים.שיתוף תרבויות של תאי עצב וגליה, סוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים, משמשים בדרך כלל כדי לחקור איתות בין סוגי התאים השונים הללו, כמו גם כדי להעריך את המשמעות של זה איתות לתגובות פיסיולוגיות, התפשטות של נזק ולבחון את מנגנונים מולקולריים הפוטנציאליים מעורבים בזה איתות 7. מחקר קודם גילה כי iPSCs האנושי להבחין מהר מאוד לתאי עצב בנוכחות של תאי עצב בקליפת המוח חולדה עיקרי תרבות המכילה, האסטרוציטים, oligodendrocytes, ומיקרוגליה 8.
בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים שיטה שמנצלת ChR2 במערכת שיתוף תרבות לחקור את קשרים סינפטיים בין תאי עצב בקליפת המוח חולדה ותאי עצב שמקורם בתאים אנושיים הנגרם pluripotent גזע (iPSCs). אנו מתארים את שלבים לנתח ורקמות מוח קציר 9, כמו גם לשמור ולבדל את תאים עצביים עכבר (NPCs) להאסטרוציטים וNPCs אדם intנוירונים o ליצור מערכת שיתוף התרבות. להקים מערכת שיתוף תרבות זו, השתמשנו בשיטת תכנות מחדש ללא אינטגרציה שתוארה על ידי אל Okita et. 10 כדי ליצור iPSCs האנושי. iPSCs אלה אז נבדל ביעילות לתוך NPCs בתנאים כימי מוגדרים באמצעות מעכבי מולקולה קטנה כפי שתוארה על ידי et al לי. 11
בשיתוף התרבויות, אוכלוסיות השונות של תאי עצב יכולות להיות מזוהות באמצעות זיהוי של ביטוי ChR2 בנוירונים בקליפת המוח ותיוג של נוירונים נגזרים iPSC באמצעות חלבון הניאון, בד בבד דימר העגבניות (tdTomato). שילוב קלטות אלקטרו מהנוירונים נגזרים iPSC עם photostimulation optogenetic של נוירונים בקליפת המוח מאפשר הערכה של היכולת של שני סוגים של תאי עצב כדי ליצור מעגלים אחד עם השני. באופן ספציפי, photostimulation של ChR2 להביע תאי עצב בקליפת המוח לעורר תגובות הסינפטי בנוירונים נגזרים iPSC שיצרו מעגלים הסינפטיעם רשת נוירון בקליפת המוח photostimulated. אנו מראים כי זרמי postsynaptic מוגברים אכן זוהו בתאי עצב שמקורם בiPSC בתנאים כאלה. פרוטוקול זה מאפשר ההערכה של מעגלים הסינפטי תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי, כוללים סיכום של דגמי מחלה נוירולוגית שונים באמצעות iPSCs נגזר מfibroblasts מחולי מחלה.
Optogenetics מספק דיוק של זמן ומרחב להפעלה של אוכלוסיות מוגדרות של נוירונים 13. בניסויים שלנו, את כל השדה של המטרה מיקרוסקופ היה מואר למשך 30 שניות לנוירונים בקליפת המוח רק צילום לעורר להביע ChR2. זה אפשר לנו לקבוע אם קשרים סינפטיים נוצרו בין אוכלוסיות השונות של תאי עצב בשיתוף התרבות. התוצאות שלנו גילו כי photostimulation מגביר תדירות PSC בנוירונים נגזרים iPSC, שמוכיח כי תאי העצב האלה לקבל קלט סינפטי מנוירונים בקליפת המוח presynaptic להביע ChR2. זה, בתורו, קבע כי נוירונים נגזרים iPSC שולבו בהצלחה במעגלים עם נוירונים בקליפת המוח.
ישנם מספר צעדים קריטיים עבור הדור של מערכת שיתוף תרבות זו. חשוב לוודא שתרבויות astrocyte נגזרים NPC העכבר בריאים, עם מותם של תאים מינימאליים, לפני שתמשיך עם ציפוישל סוגי תאים אחרים. נוירונים בקליפת המוח וNPCs האנושי לצרף גם על האסטרוציטים בריאים וקלטות אלקטרו תלויות במידה רבה בתנאי תרבות. הצעדים המרכזיים האחרים בפרוטוקול זה הם electroporation וציפוי של תאי עצב בקליפת המוח על תרבויות astrocyte. כמספר גדול של תאים מתים לאחר electroporation, חשוב להבטיח כי לפחות 6 מיליון תאי עצב בקליפת המוח הם electroporated לציפוי על תרבויות astrocyte בצלחות 24 גם. ראינו כי כאשר פחות מ -6 מיליון תאים electroporated, מספר הנוירונים ששרדו לא יוצר רשת עצבית צפופה, שהשפיעה על קלטות אלקטרו. מספר תאי העצב בקליפת המוח electroporated צריך גם להיות עקבי עבור כל ניסוי שיתוף תרבות כדי לאפשר השוואה בין מחקרים שונים. לכל השלבים כרוכים בעיכול אנזימטי, זה חיוני שלא לעזוב את התאים בתמיסת עיכול במשך זמן רב מדי מכיוון שהוא עלול להוביל למוות של תאים.
זהגישה יכולה לשמש מסך היכולת של תאי עצב שמקורם fibroblasts מטופל ספציפי ליצירת קשרים סינפטיים עם תאי עצב אחרים. נוירונים נגזרים מfibroblasts מחולים הסובלים מהפרעת נוירו-התפתחות תסמונת רט (RTT) תערוכת פגמי שידור סינפטי: תאי עצב RTT להציג ירידה משמעותית בתדירות ומשרעת PSC בהשוואה לנוירונים בריאים, ככל הנראה בשל פחות קישוריות הסינפטי 14. מערכת שיתוף התרבות שלנו מאפשרת בדיקה של שפעות תרופה על תאי עצב בו מוצגות פגמים התפתחותיים. זה יכול להתבצע באמצעות תוספת של תרכובות של ריבית במהלך הזריעה של NPCs אדם החולה, כמו גם במהלך חשיפה ממושכת לתרכובות בכל עת ההבחנה עצבית.
בעוד מערכת שיתוף תרבות זו יכולה לשמש גם כמודל לבדיקות סמים, הגבלה בגישה זו היא שהתהליך של לחקור את ההשפעות של כל מתחם מועמד יכול להיות ארוך ומייגע כזה לא שיטת הקרנת תפוקה גבוהה. בעקבות טיפול עם תרכובות מועמד, הנוירונים נגזרים iPSC צריכים להיות תוקנו בנפרד כדי לקבוע את ההשפעות של כל מתחם על PSCs. יתר על כן, יש כיום לא רב fibroblasts זמין וiPSCs מחולים. לכן, זה יהיה העניין בעתיד הקרוב לתאים חולים יותר וגם כדי להתאים פרוטוקול זה להקרנת תפוקה גבוהה. לדוגמא, על ידי תיוג נוירונים נגזרים iPSC עם מחוון פעילות, כגון חיישנים גנטי מקודדים של יונים או פוטנציאל הממברנה, אפשר יהיה להגביר את קצב התפוקה באופן משמעותי על ידי הליך אלקטרו זמן רב דריכה בצד. ככל התהליך של יצירת מערכת שיתוף תרבות זו, מתכנות מחדש fibroblasts לביצוע הקלטות אלקטרו, דורש יותר מ -90 ימים, מומלץ שיורחב גם iPSCs או NPCs האדם, לאחר תכנות מחדש וצעדי אינדוקציה עצביים בהתאמה,וcryopreserved כדי לצמצם את הזמן דרוש לניסויים עתידיים.
בניסויים שלנו, אנו הביעו ChR2 בנוירונים בקליפת המוח תחת אמרגן synapsin1. בגלל אמרגן זה פאן-עצבי, אנחנו כנראה היו photostimulating שני תאי עצב בקליפת המוח מעכבים ומעוררים. אם המטרה של ניסויים עתידיים היא לחקור את אופן ספציפי מעגלים או מעכבים או מעוררים, יכולים לשמש יזמים ספציפיים יותר. לחלופין, ניתן היו להשיג נוירונים בקליפת המוח ממהונדס (או מוזרק וירוס עכברים) שבו ביטוי ChR2 הוא ממוקד במיוחד לאוכלוסיות גנטית מוגדרות של תאי עצב. לדוגמא, רקמות קליפת המוח קציר מעכבר שיש recombinase Cre באו לידי ביטוי בinterneurons המכיל parvalbumin (interneurons PV) שהוא חצה עם עכבר עם ChR2 floxed יניב מצב שבו נוירונים בקליפת המוח רק להביע ChR2 יהיו interneurons PV 15. השימוש בChR2 להביע interneurons בנו שיתוף מ"ק כזהמערכת lture תאפשר הקביעה אם נוירון נגזר iPSC שתוקנה הוא מסוגל לשלב במעגל עם interneurons PV.
בהתבסס על מחקר קודם 9, נוירונים בקליפת המוח הם בוגרים עם חופף דנדריטים לאחר 14 ימים במבחנה. לכן, אם photostimulation לא לעורר תגובה מתא עצב נגזר iPSC טלאים, זה צריך להצביע על כך שתא העצב אין לו את היכולת ליצור קשרים סינפטיים עם תאי עצב בקליפת המוח. נוירון נגזר iPSC יכול לקבל קלט סינפטי או מתא עצב או נוירונים בקליפת המוח נגזר iPSC אחרים. אם הקלטות מהדק תיקון מסורתי שמשו, זה יהיה לא ניתן להבחין בו קלט סינפטי הוא בא. היתרון של המערכת שלנו הוא שתגובות postsynaptic מקלט סינפטי קליפת המוח יכולות להיות עורר באופן סלקטיבי וזיהו. הנהלים המתוארים כאן מספקים גישה פשוטה כדי להעריך את היכולת של הנוירונים נגזרים iPSC לשלבלרשת עצבית מוגדרת.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ק דייזרות 'וס' Je למבני lentiviral ChR2 וSynapsin1-tdTomato בהתאמה, ג חי לשיתוף מומחיות ופרוטוקול על דור iPSC, WY Leong לקבלת תמיכה טכנית, אנשי המעבדה Goh לחומרים כימיים שיתוף ומומחיות. עבודה זו נתמכה על ידי אבוט תזונה והמרכז האקדמי של אקסלנס (ACE) הפרס מחקר מGlaxoSmithKline (GSK) לElg, על ידי קרן המחקר הלאומית סינגפור במסגרת תכנית המחקר התחרותית שלה (NRF 2,008 NRF-CRP 002-082) לElg ו GJA, ועל ידי World Class המכון (WCI) התכנית של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) ממומנת על ידי משרד חינוך, מדע והטכנולוגיה של קוריאה (MEST) (NRF גרנט מספר: WCI 2,009-003) לGJA
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
SB431542 | Sigma | S4317 | |
Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
EGF | Merck Millipore | 324856 | |
FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
Papain | Worthington | 3126 | |
HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
CaCl2 | Sigma | C1016 | |
D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
K-gluconate | Sigma | P1847 | |
KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Na2ATP | Sigma | A7699 | |
Na3GTP | Sigma | G8877 | |
Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
24-well plates | Corning | 9761146 | |
6-well plates | Corning | 720083 | |
T25 flasks | Corning | 430641 | |
12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 | |