Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

NOT: Bütün deneyler SingHealth Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokolleri takip gerçekleştirilir edilir. 1. Hasat Erken Doğum Sonrası Fare Brain 1 mi 1 x Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) (+% 1 HEPES) deoksiribonükleaz I ile (DNase I) (250 U / ml) ve Dispase II (1 U / başına 10 ul papain: diseksiyon önce, hipokamp dokusunda sindirim çözelti hazırlamak mi). Doku sindirim çözeltisi yaklaşık 2.5 ml yapın ve 0.20 mikron filtre ünitesi kullanarak filtre. Kullanılana kadar 37 ° C'de çözelti, sıcak tutun. 5 dakika boyunca buz koyarak doğum sonrası gün 5 (P5) fareler yavrular uyutmak. Ayak veya kuyruk tutam yoluyla ağrı refleksi buz ve testi çıkarın. % 70 etanol ile yavrular püskürtün. Yavrular başını kesmek ve buz üzerine bir petri tabağına kafaları yerleştirin. Küçük scisso bir çift, burun kafatası tabanından, orta hat boyunca deride bir kesi yapmakrs veya ince diseksiyon forseps. Peel cildi açmak ve kafatası yoluyla benzer bir kesi yapmak. Kafatasının her iki tarafında iki ek yatay kesik, (bregmadan at) bir rostral ve (lambda at) bir kaudal olun. Peel altta yatan beyin maruz kazıma çizgiler boyunca kafatası açın. Koku ampuller örten kafatası ve aralarında herhangi bir orta hat kemiği kaldırmak için forseps bir çift kullanın. Olmayan Diseksiyon el forseps bir çift ile istikrarlı bir kafa tutarken yapın. Beynin ventral kısmı ve kuyruk ucunda kafatası tabanı arasında bir spatula düz kısmını kolaylığı. Beynin altında kafatası tabanına spatula paralel tutulması, beyin ve kafatası tabanında arasında herhangi bir yapışıklıklar koparmaya kafatası rostral sonuna doğru hareket ettirin. Spatula ile beyin oymak ve buz-soğuk 1x EBSS (+% 1 HEPES) içeren bir Petri kabındaki yerleştirin. Her zaman batık dokuları tutun. Tüm içinMikro-diseksiyon adımlar, bir mikroskop altında çalışması ve her el ince diseksiyon forseps bir çift kullanın, doku kesme biri ve istikrarlı doku tutmak için diğer. Bir kesim, sadece Beyin ayırmak için beyin korteksinde posterior olun. Iki hemisfer içine serebral korteks ayırmak için orta hat boyunca kesin. Serebral hemisferden meninksler çıkarın. Bir yarımkürede medial tarafı yukarı yerleştirin ve hipokampus altında lateral ventrikül içine forseps yerleştirin. Ortabeyin kesip. Hipokampus üst ve alt uçlarında kesikler yapın, ve dentat / entorhinal korteks kavşak yakınında korteksten hipokampus izole etmek. Buz soğukluğunda 1x EBSS (+% 1 HEPES) ihtiva eden bir tabak içinde hipokampları toplayın. 2. Hipokampal Doku Ayrılma Önceden ısıtılmış hipokampal doku sindirim çözümü içeren bir çanak hippocampi aktarın. Kıyma tMümkün olduğu kadar iyi dokuların hipokampal ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. Yavaşça, 15 ml bir santrifüj tüpüne mekanik pipetleme ve transfer hücreleri tek hücre içine dokuları ayırmak. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj çıkartıldı ve süpernatan. 20 ml içinde süspanse hücre peleti, 10 dakika boyunca 200 x g'de sakaroz (0.9 M) ve santrifüj içeren Hank Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS), 0.5X. NPC bakım ortamına (Tablo 1) 2 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın, 5 dakika süreyle 200 x g'de 1X EBSS çözeltisi ve santrifüj içinde% 4 Sığır Serum Albümini (BSA), 10 ml üstüne yerleştirilir. Süpernatantı ve hücre peleti fare NPC bakım ortamına (Tablo 1) ekleyin. Yavaşça yukarı pipet ve 5-10 kat aşağı hücre pelet tek hücre bölünür sağlamak. Önceden kaplanmış Matrigel plakalara içeren ortamda hücre transferi ve epidermal büyüme faktörü (EGF) ve tüp fibrobla eklemekHeparin st büyüme faktörü 2 (FGF2) (her ikisi de 20 ng / ml) (5 mg / ml) eklenmiştir. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe edin. Yapışık Fare Hipokampal NPC 3. Bakım En az bir saat önce Pasajlanması fare hipokampal NCPlerle kaplanmış plakalar / şişeler hazırlayın. Her bir plaka veya cam şişe yüzey alanı kapsayacak ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe olmaya yeterli Matrigel ekleyin. % 90 birleşen fare NPC kültürlerinden ortamı çıkarın ve sonra PBS aspire 1x Fosfat tamponlu tuzlu (PBS) ile bir kez yıkayın. Tüm oyuklar / şişeler kapak ve 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe için yeterli hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Tüm hücreleri 10X büyütmede ters parlak bir alan mikroskobu altında bakarak müstakil emin olun. Hala bağlı hücreler varsa, bir daha 1-2 dakika kültür gemi inkübe ve yine hücreleri kontrol edin. Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı / Ham F-12 Besin Karışımı iki miktarını ekleyin (DMEM / F-12)kuyulara hücre ayrılma çözümün olduğu gibi / şişeler kez tüm hücreler müstakil oylandı. 5 dakika süreyle 200 x g'de 15 ml santrifüj tüpüne ve santrifüj içine DMEM / F-12 içeren hücreleri aktarın. Fare NPC bakım ortamına (Tablo 1), 5 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın. Yavaşça tek hücre içine hücre pelet kırmak için aşağı yukarı pipet ve. EGF ve FGF2'nin ile desteklenmiş yeni kültür kuyuları / şişeler ve kontör yeterli kültür ortamı içine toplam hücrelerin üçte Plate. 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde kültür hazneleri inkübe edin. 3 Her 3 ila 4 gün: Orta her ikinci gün ve split hücreleri 1 doldurun. Toplanmasını ve dekolmanı önlemek için fare NPC kültürlerin üremesine kaçının. Astrositler içine Fare NPC 4. Farklılaşma Astrositlerde içine fare NPC farklılaşmasını başlatmadan önce peşin poli-L-Lizin (PLL) / laminin kaplı 12 mm kapak gözlük en az bir gün hazırlayın. Cov ekle24-iyi plaka içine erslips yeterli PLL (borat tampon maddesi içinde 1 mg / ml) ile kuyu tüm yüzey alanını kaplar. 4 ° C de gece boyunca plaka inkübe edin. Ertesi gün, PLL çıkarın ve 1x bir kez PBS ile yıkayın. Daha sonra, 37 ° C'de en az 4 saat süreyle inkübe daha iyi herbirinin bütün yüzey alanını kapsayan, (buz soğuk DMEM / F-12 içinde 1 mg / ml), laminin ekleyin. Fare NPC kültürlerinden ortamı çıkarın ve sonra PBS aspire 1x kez PBS ile yıkayın. Tüm oyuklar / şişeler kapak ve 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe için yeterli hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Tüm hücreler daha sonra müstakil DMEM / F-12 kuyu / matara hücre ayrılma çözümünün bu kadar iki kez miktar eklemek emin olun. 5 dakika süreyle 200 x g'de 15 ml santrifüj tüpüne ve santrifüj içine DMEM / F-12 içeren hücreleri aktarın. 5 ml astrosit farklılaşma ortamı (Tablo 1) süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Yavaşça pipet hücre suspension yukarı ve aşağı tek hücre içine hücre pelet kırmak için. Bir hemasitometre ile tek hücre sayısını. 5 x 10 4 hücre / cm, 24 oyuklu plakanın her bir kuyu için orta 2 500 ul plaka hücreleri. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe edin. Her ikinci gün taze ortam ile orta yarısı değiştirin. Fare NPC hızla 2 gün içinde astrositlerde içine farklılaştırmak ve başka deneyler başlamadan önce bir hafta ayrılır. 5. Hasat Embriyonik Fare Brain ve Kortikal Doku Ayrılma Astrosit kültürlerinden astrosit farklılaşma orta (Tablo 1) çıkartın ve primer nöron ortamı (Tablo 1) embriyonik fare beyinleri hasat başlamadan önce en az 4 saat ile değiştirin. 12.1 mg / ml L-sistein ile 1 mi 1x EBSS'ye (+% 1 HEPES) başına 10 ul papain: diseksiyon önce, kortikal doku sindirim solüsyon hazırlanır. Yaklaşık 2 olun0,5 doku sindirim çözeltisi ve bir 0.20 mikron filtre birimi kullanılarak filtre. Kullanılana kadar 37 ° C'de çözelti, sıcak tutun. Sıkıştırılmış gaz kullanarak karbon dioksit boğulma hamile baraj Euthanize. Ayak veya kuyruk tutam yoluyla ağrı refleks test edin. Emici ped üzerine hayvan ventral tarafı yukarı Lay ve% 70 etanol ile karın bölgesi ıslatın. Karın maruz yeterince geniş, forseps bir çift ile cildi sıkın ve cerrahi makas bir çift ile bir yanal kesi yapmak. Forseps ile periton kavrayın ve karın boşluğunu açın kesti. Forseps ile uterin boynuz yukarı kaldırın ve mesometrium boyunca ücretsiz kesti. Buz üzerinde Petri kabındaki disseke rahim yerleştirin. Aralarındaki rahim dokusunun keserek her embriyo ayırın. Embriyonik kese bir kesi yapmak. Yavaşça açıklıktan fetus dışarı kabuk. Fetüsü başını kesmek ve buz üzerinde bir Petri kabı baş koyun. Embryo hasat içinic sıçan beyinleri, adım 1,3-1,5 açıklamayı izleyin. Kortikal dokuları incelemek bir beyin hemisfer yanal yüzü yukarı yerleştirin. Orta yanal iki yarımkürede kesin. Beyin tabanına yarısı yakın atın. Ortabeyin kaldırmak için eksize doku Trim. Önceden ısıtılmış kortikal doku sindirim çözümü içeren bir çanak kortikal dokuları aktarın. Mümkün olduğu kadar ince kortikal dokular kıyma ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. Önceden ısıtılmış primer nöron ortamı (Tablo 1) 10 ml içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne doku sindirim çözeltisi kortikal dokular aktarın. Hiçbir doku parçaları ile homojen bir solüsyon elde edilinceye kadar, bir serolojik pipet defalarca onları pipetleme ve aşağı kortikal dokuları ayırmak. Kalan doku kümeleri filtrelemek için 70 mikron hücre süzgecinden doku çözümü geçirin. 15 ml doku çözeltisi alikosuHer bir tüp içinde, yaklaşık 3 ml ilave santrifüj tüplerine. Alt ve üst BSA Doku çözeltisi ile iki tabakayı oluşturan her bir tüpün dibine 1x PBS içinde 800 | il% 7.5 BSA ekleyin. 5 dakika süreyle 200 x g'de santrifüjleyin. İki katman arayüzünden, aspirasyon süpernatantı. Tüpün alt hücre pelet rahatsız kaçının. 1 ml primer nöron ortamı (Tablo 1), her bir hücre pelletini ve 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde birleştirin. Hemasitometre kullanarak hücre yoğunluğu belirleyin. 6. Elektroporasyon ve Kaplama İlköğretim Kortikal Nöronlar Not: Gen transferi, elektroporasyon, kalsiyum fosfat transfeksiyon ve viral transdüksiyon dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilebilir. Bu protokol, biz ChR2 Primer kortikal nöronların içine inşa teslim elektroporasyon açıklar. Santrifüj 6 x 10 6 sıçan kortikal nöronlar5 dakika için 200 xg t ve süpernatant kaldırmak. En az 6 x 10 6 kortikal nöronlar nöronların hayatta kalan bir nöronal ağ oluşumunu sağlamak için elektroporasyon için gereklidir. Pelet hücre ve yavaşça tekrar süspansiyon elektroporasyon çözeltisi 100 ul ekleyin. Randımanlı-synapsin-hChR2 6 ug (H134R) -EYFP-WPRE 4 plazma hücre süspansiyonu 100 ul birleştirin ve sertifikalı bir küvet içine aktarın. Aktarım sırasında hava kabarcıkları üreten kaçının. Seçin ve üreticinin talimatlarına göre elektroporasyon için uygun programı uygulamak. Elektroporasyon işleminden sonra küvete hücre / DNA süspansiyonuna MEM 500 ul ilave edin. 11.5 ml primer nöron ortamı (Tablo 1) örnek aktarın ve yavaşça yeniden süspanse edin. ortam toplam miktarı, bütün 24-delikli plaka için yeterlidir. Kısım 24 oyuklu bir plakanın her bir kuyu için ortamının 500 ul. 37 ° C'de plaka ve% 5 CO2 inkübe edin. </ol> Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin 7. Nesil NOT:. Bu yöntem Okita ark adapte edilmiştir 10 DMEM içinde kültür insanlara özgü fibroblastlar; 6-yuvalı plakalar içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. Matrigel ile fibroblastlar, kat 6-kuyu yeniden programlama başlayan ve oda sıcaklığında en az bir saat süreyle inkübe önce. % 80 izdiham, fibroblast kültürlerinden ortamı çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın. Tüm plaka kapağı ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe etmek için yeterli,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Hücreler kuyulardan yerinden sonra tripsin tripsin sindirimi söndürmek için,% 10 FBS DMEM, iki miktarını ekleyin. Yavaşça aşağı pipet hücre süspansiyonu yukarı ve hücreleri kırmak için. Bir hemasitometre ile tek hücre sayısını. 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj 5 200 xg'de hücre süspansiyonu içine aktarın 7 x 10 5 hücreMin. Süpernatantı ve elektroporasyon çözeltisi hücre pelletini. Üreticinin talimatlarına uygun olarak fibroblastlar Electroporate. Elektroporasyon tampon maddesi içinde 100 ul hücrelerin tekrar ve her bir epizomal vektörün 1 ug ekleyin. 1650 V ayarları, 10 ms ve 3 kez darbeleri ile electroporate hücreler. DMEM içine aktarın, hücre süspansiyonu,% 10 FBS ve plaka, bir 6-yuvalı plaka başına 5 x 10 4 hücreleri ile takviye edilmiştir. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe edin. 48 saat sonra, transfekte fibroblast kültürlerinden ortamı çıkarın ve mTeSR ortamı ile değiştirin. Uyarılmış pluripotent kök hücre (iPSC) koloniler izole edilmesi için hazır olana kadar günlük kültür ortamı değiştirin. iPSC koloniler 28-35 gün sonra gözlenebilir. Ne zaman izolasyonu için hazır, mekanik bir iPSC koloni kesilir ve bir Matrigel kaplı 6-çukurlu plaka 12 üzerine 10 uM, Rho-ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü (Y-27632) ile mTeSR ortamında reseed. Günlük kültür ortamı değiştirin. 8. Sinir İndüksiyon ve İnsan NPC Bakım Not:. Bu yöntem, Li ve arkadaşları tarafından tarif edilmiştir 11 IPSC kültürler% 20 birleştiği çevresinde olduğunda, mTeSR orta kaldırmak ve nöral indüksiyon ortamına (Tablo 1) ile değiştirin. Her ikinci gün orta doldurun. 7 gün sonra, sinir indüksiyon orta kaldırmak ve insan NPC bakım ortamına (Tablo 1) ile değiştirin. Kültürleri pasaj önce 7 gün orta her ikinci gün kadar doldurun. Önce en az bir saat süre ile, oda sıcaklığında Matrigel ile kültür, kaplama plakaları / şişeler pasaj. Konfluan insan NPC kültürlerden ortamı çıkarın ve sonra PBS aspire 1x kez PBS ile yıkayın. Tüm oyuklar daha sonra 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe karşılamak için yeterli hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Tüm hücreler müstakil emin olun. DMEM iki katını ekleyin /F-12 oyuk / şişelere hücre ayırma çözeltisi kadar iyi değildir. 5 dakika süreyle 200 x g'de 15 ml santrifüj tüpüne ve santrifüj içine DMEM / F-12 içeren hücreleri aktarın. 5 ml insan NPC bakım ortamına (Tablo 1) yüzer ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Yavaşça aşağı pipet hücre süspansiyonu yukarı ve hücreleri kırmak için. Plaka Matrigel kaplı kültür kuyuları / şişeler ve kontör 10 uM Y-27.632 ile desteklenmiş yeterli ortam içine toplam hücrelerin üçüncü. 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde kültür hazneleri inkübe edin. Bölünmüş kültürleri 1: 3, her 3 ila 4 gün ve her gün orta doldurmak. Farklılaşma önlemek için yüksek yoğunlukta insan NPC kültürleri korumak. Co-kültürler Nöronlar içine İnsan NPC 9. Farklılaşma Nöronların içine farklılaşmayı başlatmadan önce insan NPC kültürüne lentiviral vektör Synapsin1-tdTomato ekleyin. Astrocyte / kortikal nöron ko-kültür hazırlayınİnsan NPC ayırt önce bir gün önceden. 1x PBS ile bir kez, insan NPC kültürleri yıkayın ve kuyu kapağı için yeterli hücre ayırma çözeltisi ekleme / şişeler daha sonra 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir. Tüm hücreler müstakil emin olun. Oyuk / şişelere hücre ayırma çözeltisinin olarak DMEM / F-12 iki kez miktarını ekleyin. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine transfer edin. 5 dakika süreyle 200 x g'de santrifüjleyin. 5 ml nöronal farklılaşma ortamı (Tablo 1) süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Yavaşça pipet hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı tek hücre içine hücre pelet kırmak için. Bir hemasitometre ile tek hücre sayısını. Dikkatle astrocyte / kortikal nöron kültürlerinden orta aspire. 5 x 10 3 hücre / cm nöronal farklılaştırma ortamının 2 500 ul her bir 24 oyuklu 10 uM-Y-27632 ile desteklenmiş (Tablo 1) plaka insan NPC. Yavaşça her bir oyuğa, insan NPC içeren ortam ilaveastrositler ve kortikal nöronların rahatsız etmemek için. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe edin. En az 28 gün süreyle taze ortam ile her 2-3 gün orta yarısı değiştirin. IPSC türetilmiş nöronlar 10. Elektrofizyolojik kayıtlar İnsan iPSCs olgun nöronlar gibi davranırlar olmadığını onaylayın. Bir 60X (0.9 NA) suya daldırma lens ile donatılmış bir dik konfokal mikroskop kullanılarak tdTomato görselleştirme insan iPSCs ayırt hücreleri bulun. Harici bir çözelti içinde oda sıcaklığında 4-6 M serpmek hücre direncine pipet kayıt çekin (Tablo 1)% 95 O 05/02% CO2 ile sürekli olarak kabarcıklar halinde. İç solüsyon (Tablo 1) ile kayıt mikropipet doldurun. Cur mevcut enjeksiyon (1 sn süresi, 10 pA artışlarla) yanıt olarak bütün hücre modu ve kayıt aksiyon potansiyeli ateş yama tdTomato + hücrekelepçe kira. ChR2 ifade kortikal hücrelerin aksiyon potansiyeli güvenilir ışık uyarımı ile uyarılmış ise onaylayın. Konfokal mikroskop altında GFP görselleştirme ile ChR2 ifade kortikal hücrelerin bulun. Adımları 10.1.3 için 10.1.2 takip ederek kortikal hücreler üzerinde tüm hücre yama kelepçe kayıt yapın. Kontrol aksiyon potansiyeli güvenilir cıva ark lambası (100 W) ile hafif aydınlatma ile uyarılmış edilir. uyarılma filtreli dalga boyu 480/40 nm. Optogenetic stimülasyon gerçekleştirin. Yama tdTomato + tam hücreli modunda hücre ve -70mV ayarlanmış gerilim kelepçe. 2 kHz akım sinyallerini Filtre ve 10 kHz dijital ortama. 10 kayıtları sırasında tutarlılık için 20 M arasında değişen serisi dirençlerini izleyin. 30 saniye için 100 W cıva lambası ile 480/40 nm uyarma filtresi ile bütün alanını teşvik. Tutanak postsinaptik akımlar ve photostimulation tarafından uyarılan yamalı hücrenin (PSC'ler) presinaptik kor ChR2 ifadekortikal nöronlar. Algılama ve PSC'ler ölçün. Sırasıyla 5 pA ve 20 pC'den en genlik ve akımlar alanı için belirlenen eşik. Elle olmayan PSC izlerini silmek için bu olayları incelemek.