Optogenetic подход к оценке Формирование нейронные связи в совместной культуре системы

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводятся следующие протоколы, утвержденные уходу и использованию комитета Институциональная животных в SingHealth мимо. 1. Мозги Сбор раннем послеродовом мыши Перед вскрытия, подготовки ткани гиппокампа, пищеварение раствор: 10 мкл папаина за сбалансированный солевой раствор 1 мл 1x Эрла (EBSS) (+ 1% HEPES) дезоксирибонуклеазой I (ДНКазы I) (250 ед / мл) и диспаза II (1 U / мл). Составит примерно 2,5 мл тканевой пищеварения раствора и отфильтровать его с помощью блока с 0,20 мкм фильтр. Хранить в теплом растворе при 37 ° С до использования. Обезболить день после рождения 5 (P5) Мышь щенков, помещая их на льду в течение 5 мин. Удалить из льда и теста для боли рефлекса с помощью пальца или хвост щепотку. Спрей щенков с 70% этанола. Обезглавьте щенков и поместить голову в чашке Петри со льдом. Надрезать кожу вдоль средней линии, от основания черепа к носу, с парой небольшой scissoRS или мелкими Режущая щипцы. Пил открыть кожу и сделать подобный разрез через череп. Сделать два дополнительных горизонтальных разрезов на каждой стороне черепа, один ростральные (в темени) и один каудально (в лямбда). Пил открыть череп по надрезанные линии, чтобы разоблачить основной мозг. Используйте пару щипцов для удаления череп, покрывающий обонятельные луковицы, и любой средней линии кость между ними. Сделайте это, удерживая голову стабильный с парой щипцов в не рассекает стороны. Простота плоская часть шпателем между вентральной части мозга и основания черепа в каудальном конце. Поддержание шпатель параллельно основанию черепа при мозга, перемещать его в направлении ростральной конце черепа, чтобы разорвать любые спайки между мозгом и основание черепа. Совок мозг с помощью шпателя и поместить его в чашку Петри, содержащую ледяной 1x EBSS (+ 1% HEPES). Держите салфетки подводные во все времена. Навсегдашаги микро-рассечение, работа под микроскопом рассекает и использовать пару тонких рассекающих щипцов в каждой руке, один для резки ткани и другие для проведения ткани стабильным. Сделайте сокращение только позади коры головного мозга, чтобы отделить его от заднего мозга. Сокращение вдоль средней линии, чтобы отделить кору головного мозга в двух полушариях. Удалить мозговых оболочек из полушарий головного мозга. Поставьте полушария медиальной стороной вверх и вставьте щипцы в боковой желудочек под гиппокампа. Срежьте средний мозг. Сделать надрезы на верхней и нижней сторон гиппокампа, а рядом с зубчатой ​​/ энторинальной коры стыке изолировать гиппокамп от коры головного мозга. Сбор гиппокампа в чашку, содержащую ледяной 1x EBSS (+ 1% HEPES). 2. ткани гиппокампа диссоциации Трансфер гиппокампа в чашку, содержащую предварительно нагретой гиппокампа решение ткань пищеварения. Фарш тОн гиппокампа ткани как хорошо, как это возможно, и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С. Аккуратно отделить ткани на отдельные клетки с помощью механических пипеток и передачи клеток в 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга при 200 мкг в течение 5 мин и удалить супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в 20 мл 0.5x сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), содержащий сахарозу (0,9 М) и центрифуге при 200 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл NPC поддерживающую среду (таблица 1), размещены в верхней части 10 мл 4% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в растворе 1X EBSS и центрифуге при 200 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и добавить NPC мыши поддерживающую среду (Таблица 1) к осадку клеток. Аккуратно пипетки вверх и вниз 5-10 раз, чтобы обеспечить клеточный осадок разбивается на отдельные клетки. Передача среде, содержащей клетки в предварительно покрытых пластин Матригель и добавить эпидермальный фактор роста (EGF) и fibroblaул фактора роста 2 (FGF2) (как 20 нг / мл) в гепарина (5 мг / мл). Планшеты инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2. 3. Техническое обслуживание Приверженец мыши гиппокампа NPC, Подготовка пластинок, покрытых / колбы, по крайней мере за час до пассажи мыши гиппокампа NPC. Добавьте достаточно Матригель, чтобы покрыть площадь поверхности каждой пластины или колбы и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Удалить материал из 90% сливной мыши NPC культур и мыть один раз 1x фосфатным буферным солевым раствором (PBS), а затем аспирации PBS с. Добавьте достаточно раствора открепления клеток, чтобы покрыть все лунки / колбы и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С. Убедитесь, что все клетки были отключены, глядя под инвертированным яркой поле микроскопа на 10-кратным увеличением. Если есть еще клетки, прикрепленные, инкубировать культуры судно для дальнейшего 1-2 мин и проверьте клетки снова. Добавить в двойном размере модифицированного F-12 питательной смеси Игла Дульбекко / Хэма (DMEM / F-12)как и открепления клеток раствора в лунках / колбы сразу все клетки были отделены. Передача DMEM / F-12, содержащей клетки в 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5 мл обслуживания NPC мыши среды (таблица 1). Аккуратно пипетки вверх и вниз, чтобы разбить осадок клеток в одиночных камерах. Пластина треть от общего числа клеток в новую культуру скважин / колбы и пополнят достаточно культуральной среде, содержащей EGF и FGF2. Инкубируют сосуды для культивирования при 37 ° С и 5% СО 2. Пополнить среды каждый второй день и разбить ячейки 1: 3 раз 3 до 4 дней. Избегайте чрезмерного роста NPC мыши культур для предотвращения агрегации и отряд. 4. Дифференциация Мышь НПС в астроциты Подготовка поли-L-лизин (PLL) / ламинином покрытием 12 мм покровных стекол по крайней мере день заранее, до начала дифференциации НПС мыши в астроциты. Добавить Крытаяerslips в 24-луночный планшет и покрывают всю поверхность скважин с достаточно PLL (1 мг / мл в буфере бората). Инкубируют планшет в течение ночи при 4 ° С. На следующий день, удалить PLL и мыть один раз 1x PBS. Добавить ламинина (1 мг / мл в охлажденном льдом DMEM / F-12), снова охватывает всю поверхность каждой лунки, затем инкубируют в течение по меньшей мере 4 часа при 37 ° С. Удалить носитель из мыши NPC культур и мыть один раз 1x PBS затем аспирации PBS с. Добавьте достаточно раствора открепления клеток, чтобы покрыть все лунки / колбы и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С. Убедитесь, что все клетки отдельные затем добавить в два раза больше DMEM / F-12, что и открепления клеток раствора в лунки / колбах. Передача DMEM / F-12, содержащей клетки в 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют клетки в 5 мл астроцитов дифференцировки среды (таблица 1). Аккуратно пипетки клеток suspensioп вверх и вниз, чтобы разбить осадок клеток на отдельные клетки. Подсчитайте количество одиночных клеток с помощью гемоцитометра. Пластина клеток в 5 х 10 4 клеток / см 2 в 500 мкл среды для каждую лунку 24-луночного планшета. Планшеты инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2. Заменить половину среды свежей средой каждый второй день. Мышь НПС быстро дифференцируются в астроциты в течение 2 дней, и дифференцированы за неделю до начала дальнейших экспериментов. 5. Сбор эмбриональных крыс Мозги и корковой ткани Диссоциация Удалить астроцитов дифференциации среды (таблица 1) из астроцитов культур и заменить с первичной нейронов среды (таблица 1), по меньшей мере 4 ч до начала урожай эмбриональных мозга крысы. Перед вскрытием подготовить корковой ткани пищеварения решение: 10 мкл папаина на 1 мл 1x EBSS (+ 1% HEPES) с 12,1 мг / мл L-цистеина. Сделайте примерно 20,5 мл тканевой пищеварения решения и фильтровать с помощью блока 0,20 мкм фильтр. Хранить в теплом растворе при 37 ° С до использования. Эвтаназии беременную плотине углерода асфиксией диоксидом с использованием сжатого газа. Тест на боли рефлекса через пят или хвост щепотку. Положите животных вентральной стороной вверх на абсорбирующей прокладки и выдержите его брюшной области с 70% этанола. Ущипнуть кожу с парой щипцов и сделать боковую разрез с парой хирургическими ножницами, достаточно широкий, чтобы выставить живот. Возьмитесь за брюшину с пинцетом и разрезать брюшную полость. Поднимите рог матки с помощью пинцета и разрезать его бесплатно по mesometrium. Поместите расчлененный матки в чашку Петри со льдом. Отделите каждый эмбрион путем разрезания ткани матки между ними. Сделайте надрез в зародышевого мешка. Осторожно оболочки плода через отверстие. Обезглавьте плода, поместив голову в чашке Петри со льдом. Для уборки эмбрионакрысы мозг IC, следуйте инструкциям из шагов 1,3 до 1,5. Препарировать корковых ткани, положите полушарие мозга боковой стороной вверх. Отрежьте полушарие в двух боков от середины. Отменить половины ближе к основанию мозга. Обрезать вырезали ткань, чтобы удалить средний мозг. Передача коры ткани, чтобы блюдо с предварительно нагретой корковой решение ткань пищеварения. Фарш кортикальные ткани как хорошо, как это возможно, и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С. Передача корковых ткани из ткани пищеварения раствора в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 10 мл предварительно нагретой первичной нейронов среднего (Таблица 1). Отделить корковых тканей путем многократного пипетки вверх и вниз в серологической пипетки, пока гомогенный раствор без каких-либо частей ткани не получают. Пропустите решение ткани через сито 70 мкм клетки, чтобы отфильтровать оставшиеся ткани скопления. Алиготе ткани раствор в 15 млцентрифужные пробирки, при добавлении приблизительно 3 мл в каждую пробирку. Добавить 800 мкл 7,5% БСА в PBS 1x на дно каждой пробирки, образуя два слоя ткани с раствором сверху и БСА в нижней части. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант, аспирационных от поверхности раздела двух слоев. Во избежание нарушения клеточного осадка на дне пробирки. Ресуспендируют каждый осадок клеток в 1 мл первичной нейронов среды (таблица 1) и объединить их в 15 мл центрифужную пробирку. Определить плотность клеток с помощью гемоцитометра. 6. Электропорация и покрытия из Первичные зоны коры Нейроны Примечание: Перенос гена может быть достигнуто несколькими способами, в том числе электропорации, фосфат кальция трансфекции и вирусной трансдукции. В этом протоколе мы опишем электропорации для доставки ChR2 построить в первичных корковых нейронов. Центрифуга 6 х 10 6 крыс нейроны коры черезT 200 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. По крайней мере, 6 × 10 6 корковые нейроны, необходимые для электропорации, чтобы обеспечить формирование нейронной сети путем выживания нейронов. Добавить 100 мкл электропорации раствора осадок клеток и ресуспендируют мягко. Комбинат 100 мкл клеточной суспензии с 6 мкг Plenti-Синапсины-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 плазмиды и передавать в сертифицированной кюветы. Во избежание получения пузырьков воздуха во время передачи. Выбирать и применять соответствующую программу для электропорации в соответствии с инструкциями изготовителя. После электропорации, добавить 500 мкл MEM, чтобы клеточной суспензии / ДНК в кювете. Передача образца в 11,5 мл первичной нейронов среду (таблица 1) и ресуспендируют мягко. Общее количество средств массовой информации достаточно для всей пластине 24-а. Аликвоты 500 мкл среды для каждого лунку 24-луночного планшета. Выдержите пластину на 37 ° С и 5% СО 2. </ол> 7. Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки ПРИМЕЧАНИЕ:. Этот метод был адаптирован из Okita и др 10 Культура фибробластов человека в среде DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в 6-луночных планшетах. Перед началом перепрограммирования фибробластов, пальто 6-луночных матригелем и инкубировать в течение по крайней мере час при комнатной температуре. В 80% слияния, удалить носитель из фибробластов культур и мыть один раз 1x PBS. Добавьте достаточное количество 0,25% трипсин-ЭДТА, чтобы покрыть всю пластину и инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин. После того, как клетки были смещены из скважин, добавить в два раза больше DMEM с 10% FBS, что и трипсином для гашения трипсин-переваривание. Аккуратно пипетки клеточной суспензии вверх и вниз, чтобы разбить ячейки. Подсчитайте количество одиночных клеток с помощью гемоцитометра. Передача 7 х 10 5 клеток в 15 мл центрифужную пробирку и центрифуги клеточной суспензии в 200 мкг в течение 5минимум Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в электропорации решения. Электропорации в фибробласты в соответствии с инструкциями изготовителя. Ресуспендируют клеток в 100 мкл буфера электропорации и добавить 1 мкг каждого вектора эписомального. Электропорации клетки с настройками 1650 V, 10 мс и 3 временных импульсов. Передача клеточной суспензии в DMEM с добавлением 10% FBS и пластины 5 х 10 4 клеток на лунку 6-луночного планшета. Планшеты инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2. После 48 часов, удалите СМИ из трансфицированных культур фибробластов и заменить mTeSR среды. Заменить питательных сред ежедневно до индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) колонии не готовы быть изолированы. IPSC колонии могут наблюдаться после 28-35 дней. Когда все будет готово для изоляции, механически вырезать колонию IPSC и повторное заполнение в mTeSR среде с 10 мкМ Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) ингибитора (Y-27632) на покрытой 6-луночного планшета Matrigel 12, Ежедневно заменить культуральной среды. 8. Neural индукции и поддержания человека НПС ПРИМЕЧАНИЕ:. Этот метод был описан Li и др 11 Когда IPSC культуры являются около 20% слияния, удалить mTeSR среду и заменить нервной индукционной среде (таблица 1). Пополнить среднего каждый второй день. После 7 дней, удалить нейронной индукционной среде и заменить человека NPC поддерживающей среде (таблица 1). Пополнить среды каждый второй день до 7 дней до пересева культур. До пассажей культуры, пальто Тарелки / колбы с Matrigel при комнатной температуре в течение, по крайней мере в час. Удалить носитель из сливающихся человеческих культур NPC и мыть один раз 1x PBS затем аспирации PBS с. Добавьте достаточно открепления клеток решение, чтобы охватить все скважины, то инкубировать в течение 5 мин при 37 ° С. Убедитесь, что все клетки были отключены. Добавить в два раза больше DMEM /F-12, как и открепления клеток раствора в лунки / колбах. Передача DMEM / F-12, содержащей клетки в 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют клеток в 5 мл человеческого NPC поддерживающую среду (Таблица 1). Аккуратно пипетки клеточной суспензии вверх и вниз, чтобы разбить ячейки. Plate треть общего числа клеток в Matrigel покрытием культуры колодец / колбы и пополнят достаточно среде с добавлением 10 мкМ Y-27632. Инкубируют сосуды для культивирования при 37 ° С и 5% СО 2. Сплит культуры 1: 3 раз 3 до 4 дней и пополнения среднего каждый день. Поддержание человека культуры NPC при высокой плотности, чтобы предотвратить дифференциацию. 9. Разграничение человека НПС в нейроны в кооперативном культур Добавить лентивирусный вектор Synapsin1-tdTomato человеческой культуры NPC до начала дифференциации в нейроны. Подготовка астроцитов / корковых нейронов сопутствующих культурдень заранее, до дифференциации человека NPC. Промыть человека культуры NPC один раз 1x PBS и добавить достаточно раствора открепления клеток, чтобы охватить все лунки / колбы затем инкубировали в течение 5 мин при 37 ° С. Убедитесь, что все клетки были отключены. Добавить в два раза больше DMEM / F-12, как и открепления клеток раствора в лунки / колбах. Передача в 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют клеток в 5 мл дифференцировка нейронов среднего (таблица 1). Аккуратно пипетки клеточной суспензии вверх и вниз, чтобы разбить осадок клеток в одиночных камерах. Подсчитайте количество одиночных клеток с помощью гемоцитометра. Тщательно аспирата среды от астроцитов / корковых культур нейронов. Пластинчатые человека НПС на 5 х 10 3 клеток / см 2 в 500 мкл среды нейрональной дифференцировки (Таблица 1) с добавлением 10 мкМ Y-27632 для каждого 24-а. Аккуратно добавить носитель, содержащий человека НПС в каждую лункучтобы не потревожить астроцитов и нейронов коры. Планшеты инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2. Заменить половину среды свежей средой каждые два-три дня, по крайней мере, 28 дней. 10. Электрофизиологические Записи IPSC, полученных из нейронов Подтвердите, что человека иПСК вести себя как зрелые нейроны. Найти клетки, дифференцированные из человеческих ИПСК по визуализации tdTomato, используя вертикальную конфокальной микроскопии, оснащенный 60X (0,9 NA) погружения в воду линзы. Вынуть записи пипетки к сопротивлению от 4 до 6 М. заливать клеток при комнатной температуре во внешнем растворе (таблица 1) барботируют непрерывно с 95% O 2/5% CO 2. Заполните записи микропипетки с внутренней раствора (Таблица 1). Патч tdTomato + клеток в режиме целых клеток и записи действий потенциального стрельбы в ответ на инъекции тока (1 сек при 10 с шагом Па) в дворняжкаАренда зажим. Подтвердите, если потенциал действия корковых клеток, экспрессирующих ChR2 надежно, вызванный световой стимуляции. Найти корковых клеток, экспрессирующих ChR2 визуализацией GFP под конфокальной микроскопии. Выполните целой клетки записи патч зажим на корковых клеток, выполнив действия 10.1.2 для 10.1.3. Потенциал Проверить действие надежно, вызванный светового облучения с дуговой ртутной лампы (100 Вт). Длина волны возбуждения фильтра 480/40 нм. Выполните optogenetic стимуляции. Патч tdTomato + клеток в режиме целых клеток и установите зажим напряжение на -70mV. Фильтр текущие сигналы на 2 кГц и оцифровывать на 10 кГц. Монитор сопротивления серии, начиная от 10 до 20 м для соответствия во время записи. Стимулировать все поле 100 Вт фильтра ртутная лампа с 480/40 нм возбуждения в течение 30 сек. Запись постсинаптические токи (ЧОК) по исправленной клетки, вызванного фотостимуляцией ChR2-выражения пресинаптического Корческим нейронами. Обнаружение и измерение УИК. Установите порог амплитуды и токов области на 5 Па и 20 ПК, соответственно. Вручную проверить эти события, чтобы отменить любые нестандартные PSC следов.