Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

NOTA: Todos los experimentos se realizan siguiendo los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en SingHealth. 1. Los cerebros de cosecha temprana postnatal Ratón Antes de la disección, preparar la solución de digestión tejido del hipocampo: 10 l papaína por solución de 1 ml de 1x de Earle salina equilibrada (EBSS) (+ 1% HEPES) con desoxirribonucleasa I (ADNasa I) (250 U / ml) y dispasa II (1 U / ml). Hacer aproximadamente 2,5 ml de la solución de digestión del tejido y filtrado usando una unidad de filtro de 0,20 micras. Mantenga la solución caliente a 37 ° C hasta su uso. Anestesiar los días postnatales 5 (P5) cachorros ratones poniéndolos en hielo durante 5 min. Eliminar de hielo y prueba para el dolor reflejo a través de los pies o pellizcar la cola. Pulverizar las crías con etanol al 70%. Decapitar a los cachorros y colocar las cabezas en una placa de Petri sobre hielo. Hacer una incisión en la piel a lo largo de la línea media, de la base del cráneo hasta la nariz, con un par de pequeñas scissors o pinzas de disección finas. Abra retirando la piel y hacer una incisión similar a través del cráneo. Hacer dos cortes horizontales adicionales en cada lado del cráneo, uno rostral (en el bregma) y un caudal (en el lambda). Peel abrir el cráneo lo largo de las líneas incisas para exponer el cerebro subyacente. Use un par de pinzas para eliminar el cráneo que cubre los bulbos olfativos, y cualquier hueso línea media entre ellos. Haga esto mientras mantiene la cabeza estable con un par de pinzas en la mano no disección. Facilidad la parte plana de una espátula entre la parte ventral del cerebro y la base del cráneo en el extremo caudal. Mantener la espátula paralelo a la base del cráneo debajo del cerebro, lo mueve hacia el extremo rostral del cráneo para cortar cualquier adherencia entre el cerebro y la base del cráneo. Saque el cerebro con la espátula y colocarlo en una placa de Petri que contiene helado 1x EBSS (+ 1% HEPES). Mantenga tejidos sumergidos en todo momento. Para todospasos micro-disección, trabajo bajo un microscopio de disección y utilizar un par de pinzas de disección finas en cada mano, uno para cortar tejido, y el otro para la celebración de tejido estable. Haga un corte justo posterior a la corteza cerebral para separarlo de la parte posterior del cerebro. Corte a lo largo de la línea media para separar la corteza cerebral en sus dos hemisferios. Retire las meninges de los hemisferios cerebrales. Coloque un hemisferio lado medial e insertar los fórceps en el ventrículo lateral debajo del hipocampo. Corte el cerebro medio. Haga cortes en los extremos superior e inferior del hipocampo, y cerca del dentado / unión corteza entorrinal para aislar el hipocampo de la corteza. Recoger el hipocampo en un plato que contiene enfriado con hielo 1x EBSS (+ 1% HEPES). 2. Hipocampo Tissue Disociación Transferir el hipocampos a un plato que contiene la solución de digestión tejido del hipocampo pre-calentado. Mince tél hipocampal tejidos a lo más fina posible y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C. Disociar suavemente los tejidos en células individuales de células de pipeteado y de transferencia mecánica en un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 200 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. Resuspender pellet de células en 20 ml 0.5x Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene sacarosa (0,9 M) y se centrifuga a 200 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de medio de mantenimiento NPC (Tabla 1), colocado en la parte superior de 10 ml de 4% albúmina de suero bovino (BSA) en solución 1X EBSS y se centrifuga a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y añadir medio de mantenimiento NPC ratón (Tabla 1) al sedimento celular. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces para asegurar sedimento celular se divide en células individuales. Transferencia de las células que contienen el medio en placas de pre-recubierto con Matrigel y añadir el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y fibroblafactor de crecimiento st 2 (FGF2) (ambos de 20 ng / ml) en heparina (5 mg / ml). Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO 2. 3. Mantenimiento de Adherente ratón hipocampo NPCs Preparar las placas recubiertas / frascos al menos una hora antes de los pases de ratón NPCs hipocampo. Añadir suficiente Matrigel para cubrir el área de superficie de cada placa o matraz y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr. Retire el medio de las culturas de la APN confluente ratón 90% y lavar una vez con 1x Tampón fosfato salino (PBS) y luego aspirar PBS apagado. Agregue suficiente solución desprendimiento de las células para cubrir todos los pozos / frascos y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C. Asegúrese de que todas las células se han desprendido mirando en un microscopio de campo claro invertido a 10 aumentos. Si todavía hay células unidas, incubar recipiente de cultivo para una ulterior 1-2 minutos y verificar si las células de nuevo. Añadir el doble de la cantidad de F-12 Modificado mezcla de nutrientes medio Eagle / de Ham por Dulbecco (DMEM / F-12)como la de solución de desprendimiento de las células a los pocillos / matraces una vez que todas las células se han desprendido. Transferencia de DMEM / F-12 células que contienen en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 5 ml de medio de mantenimiento NPC ratón (Tabla 1). Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para romper sedimento celular en células individuales. Placa tercio del total de células en nuevos pozos de cultivo / frascos y rellene medio de cultivo suficiente suplementadas con EGF y FGF2. Incubar recipientes de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2. Reponer medio cada segundo día y dividir celdas 1: 3 de cada 3 a 4 días. Evite el crecimiento excesivo de las culturas de la APN ratón para evitar la agregación y el desapego. 4. Diferenciación de ratón NPCs en astrocitos Preparar poli-L-lisina (PLL) / laminina recubierto 12 mm cubreobjetos al menos un día de antelación antes de iniciar la diferenciación de los NPCs de ratón en los astrocitos. Añadir coverslips en una placa de 24 pocillos y cubrir toda la superficie de los pozos con suficiente PLL (1 mg / ml en tampón de borato). Incubar la placa durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente, eliminar PLL y lavar una vez con PBS 1x. Añadir laminina (1 mg / ml en DMEM frío de hielo / F-12), de nuevo cubriendo toda la superficie de cada pocillo, a continuación, se incuba durante al menos 4 horas a 37 ° C. Retire el medio de las culturas de la APN ratón y lavar una vez con PBS 1x luego aspirar PBS apagado. Agregue suficiente solución desprendimiento de las células para cubrir todos los pozos / frascos y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C. Asegúrese de que todas las células se han desprendido a continuación, añadir el doble de la cantidad de DMEM / F-12 como el de la solución de desprendimiento de las células de los pozos / frascos. Transferencia de DMEM / F-12 células que contienen en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml medio de diferenciación de astrocitos (Tabla 1). Suavemente suspensio celular pipetan arriba y hacia abajo para romper sedimento celular en células individuales. Contar el número de células individuales con un hemocitómetro. Células de la placa en 5 x 10 4 células / cm 2 en 500 l de medio de cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO 2. Reemplace la mitad del medio por medio fresco cada dos días. Ratón NPC diferenciar rápidamente en astrocitos dentro de 2 días y se diferencian por una semana antes de comenzar otros experimentos. 5. Brains cosecha embrionarias de rata y la disociación del tejido cortical Retire medio de diferenciación de astrocitos (Tabla 1) a partir de cultivos de astrocitos y reemplazar con medio neurona primaria (Tabla 1) al menos 4 horas antes de comenzar la cosecha de los cerebros de ratas embrionarias. Antes de la disección, preparar la solución de digestión del tejido cortical: 10 l papaína por 1 ml de 1x EBSS (+ 1% HEPES) con 12,1 mg / ml L-cisteína. Realiza aproximadamente 20,5 ml de la solución de digestión de los tejidos y filtrarla usando una unidad de 0,20 micras filtro. Mantenga la solución caliente a 37 ° C hasta su uso. La eutanasia a la presa embarazada por asfixia con dióxido de carbono usando gas comprimido. Prueba de dolor reflejo a través de los pies o pellizcar la cola. Coloque la cara ventral de los animales sobre una almohadilla absorbente y disfrutar de su zona abdominal con etanol al 70%. Pellizcar la piel con un par de pinzas y hacer una incisión lateral con un par de tijeras quirúrgicas, lo suficientemente amplia como para exponer el abdomen. Agarre el peritoneo con las pinzas y cortar abrir la cavidad abdominal. Levante el cuerno uterino con las pinzas y cortarla libre a lo largo del mesometrio. Coloque el útero diseccionado en un plato de Petri sobre hielo. Separar cada embrión cortando el tejido uterino entre ellos. Hacer una incisión en el saco embrionario. Shell suavemente el feto a través de la abertura. Decapitar al feto y colocar la cabeza en una placa de Petri sobre hielo. Para cosechar embryonlos cerebros de ratas ic, siga la descripción de los pasos 1.3 a 1.5. Para diseccionar los tejidos corticales, coloque un hemisferio cerebral lateral arriba. Cortar el hemisferio en dos lateralmente desde el centro. Desechar el medio más cerca de la base del cerebro. Recorte el tejido extirpado para eliminar el cerebro medio. Transferir los tejidos corticales a un plato que contiene la solución de digestión del tejido cortical pre-calentado. Picar los tejidos corticales a lo más fina posible y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C. Transferir los tejidos corticales a partir de la solución de digestión del tejido a un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 10 ml de medio neurona primaria pre-calentado (Tabla 1). Disociar los tejidos corticales pipeteando repetidamente hacia arriba y hacia abajo en una pipeta serológica, hasta que se obtiene una solución homogénea sin piezas de tejido. Pasar la solución de los tejidos a través de un filtro de células de 70 micras para filtrar los restantes grumos de tejido. Alícuota de la solución de tejido en 15 mltubos de centrífuga, añadiendo aproximadamente 3 ml en cada tubo. Añadir 800 l 7,5% de BSA en PBS 1x a la parte inferior de cada tubo, formando dos capas con la solución de tejido en la parte superior y BSA en la parte inferior. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante, la aspiración desde la interfaz de las dos capas. Evitar alterar el sedimento celular en la parte inferior del tubo. Resuspender cada sedimento celular en 1 ml de medio neurona primaria (Tabla 1) y combinarlos en un tubo de centrífuga de 15 ml. Determinar la densidad de células usando un hemocitómetro. 6. La electroporación y Chapado de Primaria neuronas corticales NOTA: La transferencia de genes se puede lograr usando varios métodos, incluyendo electroporación, transfección de fosfato de calcio y transducción viral. En este protocolo, se describe la electroporación para entregar ChR2 construir en neuronas corticales primarias. Centrifugar 6 x 10 6 neuronas corticales de rata unaT 200 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. Se requieren al menos 6 x 10 6 neuronas corticales para la electroporación para asegurar la formación de una red neuronal por neuronas supervivientes. Añadir 100 l de solución de electroporación a la celda de pellets y resuspender suavemente. Combinar 100 l de la suspensión celular con 6 g de PLENTI-Synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plásmido y transferir en una cubeta certificado. Evitar la producción de burbujas de aire durante la transferencia. Seleccionar y aplicar programa apropiado para la electroporación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la electroporación, añadir 500 l de MEM para suspensión de células / ADN a la cubeta. Transferir la muestra en 11,5 ml de medio neurona primaria (Tabla 1) y resuspender suavemente. El importe total de los medios de comunicación es suficiente para una placa entera de 24 pocillos. Alícuota de 500 l de medio de cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar la placa a 37 ° C y 5% de CO 2. </ol> 7. Generación de células madre pluripotentes inducidas NOTA:. Este método ha sido adaptado de Okita et al 10 Cultura fibroblastos humanos en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) en placas de 6 pocillos. Antes de iniciar una reprogramación de fibroblastos, capa 6 pocillos con Matrigel y se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente. Al 80% de confluencia, quitar el medio de cultivos de fibroblastos y lavar una vez con PBS 1x. Añadir suficiente 0,25% de tripsina-EDTA para cubrir toda la placa y se incuba a 37 ° C durante 10 min. Una vez que las células han desalojado de pozos, añadir el doble de la cantidad de DMEM con 10% de SFB como la de la tripsina para calmar la digestión con tripsina. Suavemente pipeta suspensión de células arriba y hacia abajo para romper las células. Contar el número de células individuales con un hemocitómetro. Transferencia de 7 x 10 5 células en un tubo de centrífuga de 15 ml y la suspensión de células a 200 xg durante 5 centrífugamin. Eliminar el sobrenadante y resuspender sedimento de células en solución de electroporación. Electroporar los fibroblastos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resuspender las células en 100 l de tampón de electroporación y añadir 1 g de cada vector episomal. Células electroporar con ajustes de 1.650 V, 10 ms y 3 pulsos de tiempo. Transferencia de suspensión de células en DMEM suplementado con 10% FBS y la placa 5 x 10 4 células por pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO 2. Después de 48 horas, quitar el medio de cultivos de fibroblastos transfectadas y reemplazar con medio mTeSR. Reemplace los medios de cultivo diariamente hasta celulares madre pluripotentes inducidas (IPSC) colonias están listos para ser aislado. colonias IPSC pueden observarse después de 28 a 35 días. Cuando esté listo para el aislamiento, cortar mecánicamente una colonia de IPSC y sembrar de nuevo en un medio mTeSR con 10 asociada a Rho mu M proteína quinasa (ROCK) inhibidor (Y-27632) en una placa de 6 pocillos recubiertos con Matrigel 12. Reemplazar medio de cultivo diariamente. 8. Neural la inducción y mantenimiento de NPCs Humanos NOTA:. Este método ha sido descrito por Li et al 11 Cuando los cultivos IPSC son alrededor de un 20% de confluencia, retire medio mTeSR y reemplazar por medio de inducción neural (Tabla 1). Reponer medio cada dos días. Después de 7 días, retire el medio de inducción neural y reemplazar con medio humano mantenimiento NPC (Tabla 1). Reponer medio cada dos días hasta 7 días antes de pases culturas. Antes de pases culturas, placas cubren / frascos con Matrigel a temperatura ambiente durante al menos una hora. Retire el medio de la APN culturas humanas confluentes y lavar una vez con PBS 1x luego aspirar PBS apagado. Agregue suficiente solución desprendimiento de las células para cubrir todos pocillos y se incuban durante 5 minutos a 37 ° C. Asegúrese de que todas las células se han desprendido. Añadir el doble de la cantidad de DMEM /F-12 como el de la solución de desprendimiento de las células a los pocillos / frascos. Transferencia de DMEM / F-12 células que contienen en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 5 ml de medio de mantenimiento NPC humana (Tabla 1). Suavemente pipeta suspensión de células arriba y hacia abajo para romper las células. Placa tercio del total de células en Matrigel recubiertos cultura pozos / frascos y rellene medio suficiente suplementado con 10 mM Y-27632. Incubar recipientes de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2. Culturas divididas 1: 3 cada 3 o 4 días y reponer medio cada dos días. Mantener culturas NPC humanos en alta densidad para evitar la diferenciación. 9. Diferenciación de NPCs Humanos en neuronas en co-culturas Añadir el vector lentiviral Synapsin1-tdTomato a la cultura de la APN humana antes de iniciar la diferenciación en neuronas. Preparar astrocito / neurona cortical co-cultivosun día de antelación antes de diferenciarse NPCs humanos. Lávese las culturas NPC humanos una vez con PBS 1x y añadir suficiente solución desprendimiento de las células para cubrir todos los pozos / frascos luego incubar durante 5 minutos a 37 ° C. Asegúrese de que todas las células se han desprendido. Añadir el doble de la cantidad de DMEM / F-12 como el de solución desprendimiento de las células a los pocillos / frascos. Transferir a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 5 ml de medio de diferenciación neuronal (Tabla 1). Suavemente pipeta suspensión de células arriba y hacia abajo para romper sedimento celular en células individuales. Contar el número de células individuales con un hemocitómetro. Aspirar cuidadosamente medio de cultivos de neuronas corticales de astrocitos /. Placa NPCs humanos a 5 x 10 3 células / cm 2 en 500 l de medio de diferenciación neuronal (Tabla 1) suplementado con 10 mM Y-27632 para cada 24 pocillos. Añadir con cuidado medio que contiene NPCs humanos en cada pocillopara evitar molestar a los astrocitos y neuronas corticales. Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO 2. Reemplazar la mitad del medio con medio fresco cada dos a tres días durante al menos 28 días. 10. Registros electrofisiológicos de las neuronas derivadas de IPSC Confirme si iPSCs humanos se comportan como neuronas maduras. Encuentra células diferenciadas a partir de células iPS humanas de visualización de tdTomato utilizando un microscopio confocal vertical equipado con un 60X (0,9 NA) lente de inmersión en agua. Tire grabación pipeta para una resistencia de 4 a 6 células de M. perfundir a temperatura ambiente en una solución externa (Tabla 1) burbujeó constantemente con 95% de O2 / 5% de CO 2. Llene la micropipeta de grabación con solución interna (Tabla 1). Celular Patch tdTomato + en el modo de célula completa y la acción récord potencial de disparo en respuesta a la inyección de corriente (1 segundos de duración, incrementos de 10 Pa) en curalquilar abrazadera. Confirme si el potencial de acción de las células corticales que expresan ChR2 se evoca de forma fiable por estimulación de la luz. Encuentra células corticales que expresan ChR2 por la visualización de las buenas prácticas agrarias con un microscopio confocal. Realice la grabación de patch clamp de células enteras en las células corticales siguiendo los pasos 10.1.2 a 10.1.3. Comprobar potencial de acción se evoca de forma fiable por una iluminación de luz con lámpara de arco de mercurio (100 W). La longitud de onda de filtro de excitación es 480/40 nm. Realice la estimulación optogenética. TdTomato Patch + celular en modo de célula completa y fijación de voltaje fijado en -70 mV. Filtra señales de corriente a 2 kHz y digitalizar a 10 kHz. Monitor de resistencias en serie que van desde 10 a 20 m para la consistencia durante las grabaciones. Estimular todo terreno por 100 W filtro lámpara de mercurio con 480/40 nm de excitación durante 30 segundos. Postsináptica corrientes de Registros (PSC) de células parcheado inducida por fotoestimulación de ChR2 expresan cor presinápticaneuronas ticos. Detectar y medir PSC. El umbral de la amplitud y la zona de las corrientes a las 5 y 20 pA PC, respectivamente. Inspeccionar manualmente estos eventos para descartar cualquier rastro no PSC.