A PCR-based protocol was adapted to detect Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes from body surfaces and alimentary canals of individual wild-caught flies. The goal of this protocol is to detect and isolate bacterial pathogens from individual insects collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations.
There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a particular foodborne illness outbreak has been challenging. This is because insects are not being aseptically collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations and because there is not a standardized method to detect foodborne bacteria from individual insects. To take a step towards solving this problem, we adapted a protocol from a commercially available PCR-based system that detects foodborne pathogens from food and environmental samples, to detect foodborne pathogens from individual flies.Using this standardized protocol, we surveyed 100 wild-caught flies for the presence of Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes and demonstrated that it was possible to detect and further isolate these pathogens from the body surface and the alimentary canal of a single fly. Twenty-two percent of the alimentary canals and 8% of the body surfaces from collected wild flies were positive for at least one of the three foodborne pathogens. The prevalence of Cronobacter spp. on either body part of the flies was statistically higher (19%) than the prevalence of S. enterica (7%) and L.monocytogenes (4%). No false positives were observed when detecting S. enterica and L. monocytogenes using this PCR-based system because pure bacterial cultures were obtained from all PCR-positive results. However, pure Cronobacter colonies were not obtained from about 50% of PCR-positive samples, suggesting that the PCR-based detection system for this pathogen cross-reacts with other Enterobacteriaceae present among the highly complex microbiota carried by wild flies. The standardized protocol presented here will allow laboratories to detect bacterial foodborne pathogens from aseptically collected insects, thereby giving public health officials another line of evidence to find out how the food was contaminated when performing foodborne outbreak investigations.
Insetti svolgono un ruolo importante nella trasmissione di malattie legate perché possono diffondersi patogeni alle superfici e utensili 1 alimenti o contatto con gli alimenti. Tra gli insetti, mosche, scarafaggi, formiche e mostrano comportamenti che favoriscono la diffusione di agenti patogeni di origine alimentare. Questi comportamenti sono una associazione con la materia in decomposizione, rifiuti e feci, (edifici entrano) endophily, e synanthropy (convivente con gli esseri umani) 2. .. Patogeni come Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp, Escherichia coli O157: H7, e membri del genere Cronobacter (ex Enterobacter sakazakii) sono stati segnalati per essere trasmessa da insetti 3-5. Sporcizia sinantropici vola sviluppa meccanicamente batteri di origine alimentare trasferendo patogeni dalle loro superfici corporee contaminate. Tuttavia, la presenza di patogeni nel canale alimentare di linea può essere fino a tre voltesuperiore a quella osservata sulle superfici del corpo (il corpo, testa, gambe e ali) 5. Patogeni possono rimanere nel canale alimentare della mosca per una maggiore lunghezza di tempo che sulla superficie del corpo 6,7 e in alcuni casi, sono in grado di moltiplicarsi, colonizzando digerente 4,8,9 tratto della mosca. Questo aumenta il potenziale vettore di mosche perché possono diffondere ulteriormente patogeni di origine alimentare attraverso la defecazione e rigurgito 10,11.
Oggi, ci sono migliorati i sistemi di sorveglianza in grado di rilevare le epidemie di origine alimentare malattie più rapidamente. Durante l'esecuzione di indagini sui focolai di origine alimentare, funzionari della sanità pubblica cercano il cibo che può essere la fonte (s) o veicolo (s) di infezione. Gli investigatori possono anche eseguire una valutazione ambientale della struttura (o servizi) coinvolti per scoprire come il cibo è stato contaminato e possono raccogliere campioni nell'ambito delle indagini 12. Despite la vasta letteratura scientifica riguardante insetti come vettori di agenti patogeni di origine alimentare, che collega gli insetti come vettori del patogeno causando un focolaio di infezione particolare malattia è stato impegnativo. Questo è principalmente perché gli insetti non vengono asettico raccolti come parte di programmi di campionamento ambientale durante indagini sui focolai di origine alimentare. Per includere gli insetti, in particolare quelli che presentano comportamenti che favoriscono la diffusione di agenti patogeni di origine alimentare, nell'ambito di una procedura di campionamento ambientale, un protocollo standardizzato, veloce, sensibile e affidabile per rilevare patogeni di origine alimentare da un singolo insetto deve essere a posto.
Tecniche di placcatura tradizionali per l'individuazione di agenti patogeni di origine alimentare da insetti sono laboriosi e dipendono la crescita competitiva dei batteri bersaglio in terreni di coltura diverse per superare la rapida crescita del microbiota commensale innata dell'insetto. La maggior parte degli studi che hanno associato gli insetti con bapatogeni cterial hanno aumentato la sensibilità del metodo, raggruppando insieme più insetti piuttosto che identifica la presenza di patogeni su una base per individuo. Così, questi studi non hanno differenziare la parte del corpo dell'insetto dove sono stati trovati i 13-18 patogeni. La capacità di identificare se patogeni di origine alimentare si trovano sulla superficie del corpo o nel canale alimentare di un individuo insetto è importante in quanto ciò potrebbe avere implicazioni epidemiologiche e può portare a diverse strategie di mitigazione. Come vettori meccanici, mosche quella terra sul cibo per breve tempo possono trasferire i bassi livelli di batteri dal loro superficie corporea, mentre quelle mosche che rigurgitano e defecare sul cibo aumentare la probabilità di patogeni trasferimento a livelli potenzialmente più elevati di infezione. Di conseguenza, è importante stimare la prevalenza di un agente patogeno alimentare per un individuo insetti e differenziare la parte del corpo di insetto che dove il p batterica athogen si trova.
Anche se l'uso di metodi di coltura indipendente per rilevare patogeni sono sempre in fase di attuazione, non sono stati utilizzati commercialmente per rilevare patogeni da un unico insetto. Attualmente, ci sono convalidate protocolli molecolari che sono disponibili in commercio per la rapida individuazione di agenti patogeni di origine alimentare dagli alimenti che vengono utilizzati dall'industria e agenzie di regolamentazione. Questi metodi includono sistemi basati sul DNA per il rilevamento di agenti patogeni in una varietà di campioni alimentari. Sebbene i protocolli molecolari sono più veloci rispetto ai metodi tradizionali di placcatura, arricchimento del campione è ancora necessaria per ottenere il livello di sensibilità di 10 2 unità formanti colonie (CFU) del batterio patogeno necessaria reazione a catena della polimerasi (PCR) Metodi basati 19. Inoltre, è necessario l'isolamento di colonie batteriche pure da campioni PCR-positivi per confermare l'agente patogeno con metodi adeguati.
content "> Lo scopo di questo protocollo è di standardizzare un sistema basato su PCR disponibile in commercio usato per rilevare patogeni dai campioni alimentari e ambientali per la rilevazione di batteri alimentari dalla superficie del corpo e del canale alimentare di una mosca e per isolare ulteriormente quelli patogeni dalla sensibilità samples.The del protocollo qui descritto è stato prima tarati con mosche domestiche adulti laboratorio allevati (Musca domestica) che sono stati sperimentalmente alimentati con diluizioni seriali di ogni patogeno batterico. Il protocollo standardizzato è stato successivamente utilizzato per rilevare 100 catturati vola per la presenza di agenti patogeni di origine alimentare dalle loro superfici del corpo e / o canali alimentari. Questo protocollo standardizzato consentirà laboratori di sanità pubblica per rilevare minacce per la salute derivanti da insetti, consentendo la possibilità di raccoglierle come parte del programma di campionamento ambientale durante l'esecuzione di origine alimentare indagini sui focolai.Studi precedenti che hanno rilevato gli agenti patogeni di origine alimentare dagli insetti selvatici hanno utilizzato una grande varietà di protocolli che potrebbero non includere le informazioni necessarie per valutare con precisione i rischi alimentari legati alla presenza di una mosca in alimenti o ambienti legati all'alimentazione 13,15, 23,24. Qui, abbiamo dimostrato che l'utilizzo di questo protocollo standardizzato, è possibile rilevare e isolare Cronobacter spp., S. enterica, e L. monocytogenes dalla superficie del corpo e del canale alimentare dei singoli mosche catturati in natura. Poiché gli insetti possono trasportare un numero ridotto di patogeno bersaglio di origine alimentare e un numero elevato di altri microbiota indigeno 25,26, questo protocollo richiede arricchimento primario (e talvolta secondaria) dei campioni in terreni di coltura specifici per aumentare la sensibilità di rilevamento del patogeno bersaglio di origine alimentare . I risultati del sistema di rilevazione basato sulla PCR sono stati ottenuti entro circa 30 ore (per il detection di Cronobacter spp. e S. enterica) e 48 ore (per il rilevamento di L. monocytogenes) dopo l'elaborazione iniziale dei campioni. Così, questo protocollo è affidabile e rapido ed abbastanza sensibile per lo screening una mosca per la presenza di patogeni.
Conferma dei risultati PCR-positivi e l'isolamento di batteri vitali è parte della procedura standard di molti laboratori. Inoltre, a fini epidemiologici, colture batteriche pure da campioni PCR-positivi sono tenuti a confermare ulteriormente e il sierotipo del patogeno di origine alimentare utilizzando biochimici, immunologici, o metodi genetici. Anche se non sono state osservate falsi positivi quando rileva S. enterica e L. monocytogenes dalle parti del corpo dei singoli mosche catturati, con questo protocollo, abbiamo trovato fino ad un tasso del 50% di falsi positivi per Cronobacter spp. Ciò suggerisce che il sistema di rilevazione basato sulla PCR per il genere CronobactER possono attraversare-reagire con altre Enterobacteriaceae presente tra il molto complesso microbiota portato dalle mosche. Pertanto, l'isolamento e la purificazione di colonie puri del Cronobacter genere da campioni PCR-positivi richiedono placcatura più selettivo rispetto agli altri patogeni valutati.
Questo protocollo è stato soprattutto standardizzato per lo screening individuale mosche-selvatici catturati per la presenza di Cronobacter spp., S. enterica, e L. monocytogenes utilizzando un sistema di rilevamento basato su PCR commerciale. Tuttavia, questo protocollo è stato anche facilmente adattato per schermare singole parti del corpo di mosche per la presenza di altri patogeni quali enteroemorragica E. coli O157: H7 (utilizzando E. coli O157: H7 MP kit di dosaggio standard o E. coli O157: H7 kit di analisi in tempo reale) e la E. shiga-tossigenici coli (STEC) gruppo (utilizzando la suite di STEC in tempo reale), sensibilità ottenendo> 80% (Annulla pubblicazionedati ndr). Inoltre, questo protocollo può potenzialmente essere adattata per rilevare patogeni di origine alimentare da altri insetti che sono noti vettori di malattie (scarafaggi e formiche), ma più ricerca in questo campo è necessario.
Origine alimentare indagini malattia focolai sono molto dinamici e comprendono un processo multi-step che può variare a seconda della situazione specifica e l'ambiente locale indagato 12,27. Queste indagini sono importanti perché forniscono immediata protezione della salute pubblica prevenendo malattie future. Inoltre, queste indagini possono chiarire nuovi meccanismi con cui i microrganismi di origine alimentare sono diffuse, e sollevare questioni importanti che portano a nuove aree di ricerca 28. Tecniche investigative nonché protocolli standardizzati, rapidi, e sensibili sono necessari per la rilevazione di agenti patogeni di origine alimentare dai singoli insetti. Questo protocollo standardizzato apre la possibilità di raccogliere in modo asettico insetti come mosche, which può vettore del batterio patogeno di origine alimentare, come parte di un programma di campionamento ambientale. Le informazioni epidemiologiche che si possono ottenere da questo sarebbe di impiego nella costruzione di un quadro preciso dei meccanismi di trasmissione di agenti patogeni di origine alimentare dagli insetti (cioè, la durata del tempo di esposizione: una mosca atterrando contro mosche atterraggio, defecare, e rigurgitare).
Infine, anche se il sistema di rilevamento basato su PCR commerciale qui descritto è pratico da usare e semplifica amplificazione PCR e visualizzazione di un amplicone-livello di genere, è affatto l'unico sistema appropriato. Il lisato da campioni arricchiti potrebbe in alternativa essere usato per individuare la presenza di agenti patogeni di origine alimentare utilizzando pubblicamente disponibili coppie di primer specifici per specie. Tuttavia, la sensibilità di rilevazione deve essere dimostrata prima del loro utilizzo.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Ben D. Tall, Yi Chen, and Thomas Hammak from the U.S. Food and Drug Administration (FDA), Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) for critically reviewing the manuscript. The authors also thank Hannah Lee (research internship program, Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition (JIFSAN), University of Maryland) for laboratory assistance and David Weingaertner (FDA, CFSAN) for preparing the figure of the schematic overview shown in the video.
Bismuth sulfite (BS) agar | Fisher Scientific | R452402 | *Multiple suppliers. |
Brain heart infusion (BHI) broth | Becton, Dickson and Company | 299070 | *Pre-warmed to 37°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Listeria agar (BLA) | Fisher Scientific | CM1080B | *Multiple suppliers. |
Buffered peptone water (BPW) | Becton, Dickson and Company | 212367 | *Pre-warmed to 37°C or 42°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen formulation/DFI) | Fisher Scientific | CM1055B | *Multiple suppliers. |
chromID Sakazakii Agar | bioMérieux | 43741 | *Call for information: 800.682.2666 |
R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Chromogenic Plating Medium | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
R & F Enterobacter sakazakiii Enrichment Broth and supplement | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
Hektoen enteric (HE) agar | Fisher Scientific | OXCM0419B | *Multiple suppliers. |
24 Listeria enrichment broth (24LEB) | Oxoid | CM1107 | *Freshly prepared at room-temperature. Multiple suppliers. |
Listeria selective enrichment supplement | Oxoid | SR0243 | *Multiple suppliers. |
Novobiocin | Fisher Scientific | OXSR0181E | *Multiple suppliers. Store at 2-8 °C |
Vancomycin hydrochloride hydrate | Sigma Aldrich | 861987 | Store at 2-8 °C |
Cefsulodin sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | C8145 | Store at 2-8 °C |
Rappaport-Vassiliadis (RV) medium | Fisher Scientific | CM0669B | *Multiple suppliers. |
Tetrathionate (TT) Broth | Becton, Dickson and Company | 249120 | *Multiple suppliers. |
Trypticase soy agar (TSA) | Becton, Dickson and Company | 236930 | *Multiple suppliers. |
Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar | Becton, Dickson and Company | 221284 | *Multiple suppliers. |
API Biochemical identification system | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2666 |
VITEK 2: Product Safety | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2667 |
BAX System Q7 | DuPont | N/A | |
BAX E. sakazakii Standard assay kit | DuPont | D11801836 | * |
BAX L. monocytogenes 24E assay kit | DuPont | D13608125 | * |
BAX Salmonella 2 Standard assay kit | DuPont | D14368501 | * |
Capping tool | DuPont | D11677028 | |
Decapping tool | DuPont | D11134095 | |
PCR tube rack/holder | DuPont | D12701663 | |
Featherweight forceps, wide tip | BioQuip | 4750 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Fine point, straight tip forceps | BioQuip | 4731 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Zirconia/silica beads, 0.5 mm | Bio Spec Products, Inc. | 11079105z | Multiple suppliers. |
Petri dishes – 60X15mm | Fisher Scientific | 08-772B | Multiple suppliers. |
Disposable inoculating loops, 10µL | Fisher Scientific | 22-363-606 | Multiple suppliers. |
L-shaped cell spreaders | Fisher Scientific | 14-665-230 | Multiple suppliers. |
Microcentrifuge tubes, 2 ml | Fisher Scientific | Various | Sterilize before use when needed. Secure lid is preferred. Multiple suppliers. |
Cluster tubes | Fisher Scientific | 05-500-13 | |
Cluster tubes caps | Fisher Scientific | 05-500-23 | |
Sodium hypochlorite (Liquid chlorine bleach) | N/A | N/A | *Dilute to 0.05% with water. Multiple suppliers. |
Sterile deionized water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Sterile distilled water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Ethyl alcohol 190 proof | N/A | N/A | *Dilute to 70% with water when needed. Multiple suppliers. |
Genie cell disruptor, 120V – for 1.5ml and 2.0ml microtubes | Scientific Industries, Inc. | SI-D238 | Multiple suppliers. |
Heating block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Cooling block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Recirculating water bath | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Stereo microscope | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Centrifuge | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Incubator | N/A | N/A | Multiple suppliers. |