A PCR-based protocol was adapted to detect Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes from body surfaces and alimentary canals of individual wild-caught flies. The goal of this protocol is to detect and isolate bacterial pathogens from individual insects collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations.
There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a particular foodborne illness outbreak has been challenging. This is because insects are not being aseptically collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations and because there is not a standardized method to detect foodborne bacteria from individual insects. To take a step towards solving this problem, we adapted a protocol from a commercially available PCR-based system that detects foodborne pathogens from food and environmental samples, to detect foodborne pathogens from individual flies.Using this standardized protocol, we surveyed 100 wild-caught flies for the presence of Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes and demonstrated that it was possible to detect and further isolate these pathogens from the body surface and the alimentary canal of a single fly. Twenty-two percent of the alimentary canals and 8% of the body surfaces from collected wild flies were positive for at least one of the three foodborne pathogens. The prevalence of Cronobacter spp. on either body part of the flies was statistically higher (19%) than the prevalence of S. enterica (7%) and L.monocytogenes (4%). No false positives were observed when detecting S. enterica and L. monocytogenes using this PCR-based system because pure bacterial cultures were obtained from all PCR-positive results. However, pure Cronobacter colonies were not obtained from about 50% of PCR-positive samples, suggesting that the PCR-based detection system for this pathogen cross-reacts with other Enterobacteriaceae present among the highly complex microbiota carried by wild flies. The standardized protocol presented here will allow laboratories to detect bacterial foodborne pathogens from aseptically collected insects, thereby giving public health officials another line of evidence to find out how the food was contaminated when performing foodborne outbreak investigations.
Насекомые играют важную роль в передаче болезней, связанных с питанием, потому что они могут распространяться патогены пищевых продуктов или контактных поверхностей и посуды 1. Среди насекомых, мух, тараканов, и муравьи проявляют поведение, которые способствуют распространению возбудителей пищевого происхождения. Такое поведение включает ассоциацию с распадающейся материи, отказаться и фекалии, endophily (ввод здания), и synanthropy (сожительство с человека) 2. .. Пищевых патогенов, таких как сальмонелла, листерий, Campylobacter SPP, кишечная палочка O157: H7, и члены рода Cronobacter (ранее Enterobacter sakazakii), как сообщается, передаваемых насекомыми 3-5. Синантропных грязь летит механически распространять пищевых бактерий путем передачи патогенов из своих загрязненных поверхностей тела. Тем не менее, наличие пищевых патогенов в желудочно-кишечном тракте мух может быть до трех разбольше, чем это наблюдалось на их поверхности тела (тело, голова, ноги и крылья) 5. Пищевые патогены могут также оставаться в желудочно-кишечном тракте мухи для большей продолжительности, чем на поверхности тела 6,7, а в некоторых случаях они способны размножаться, колонизации желудочно-кишечного 4,8,9 мухи путей. Это увеличивает векторный потенциал мух так как они могут дальнейшего распространения пищевых патогенов через дефекации и регургитации 10,11.
В настоящее время существует улучшать системы эпиднадзора, которые способны выявлять вспышки болезней пищевого происхождения более быстрыми темпами. При выполнении пищевого происхождения при расследовании вспышек эпидемий, чиновники системы здравоохранения искать пищу, которая может быть источником (ы) или носитель (ы) инфекции. Следователи также может выполнять экологическую оценку объекта (или объектов), участвующих чтобы узнать, как еда была загрязнена и может собирать образцы в рамках расследования 12. DespITE огромное количество научной литературы, касающейся насекомых в качестве носителей возбудителей пищевого происхождения, соединяющей насекомых в качестве переносчиков возбудителя конкретная вспышка болезни пищевого происхождения был сложным. Это главным образом потому насекомые не стерильно, собранные в рамках программ отбора проб окружающей среды во время пищевого происхождения расследования вспышек. Чтобы включить насекомых, особенно тех, которые обладают поведения, которые способствуют распространению возбудителей пищевого происхождения, как часть процедуры отбора проб окружающей среды, стандартизации, быстрых, чувствительных и надежных протокола обнаружения пищевых патогенов из одного насекомого должен быть на месте.
Традиционные методы металлизации для обнаружения пищевых патогенов от насекомых являются трудоемкими и зависят от конкурентной роста бактерий-мишеней в различных питательных сред для преодоления быстрого роста врожденной комменсальной микрофлоры насекомого. Большинство исследований, которые, связанных с насекомыми с баcterial патогены увеличили чувствительность метода путем объединения вместе несколько насекомых, а не установления присутствия патогенов на на индивидуальной основе. Таким образом, эти исследования не отличить части тела насекомого где патогены были найдены 13-18. Способность определить, является ли пищевых патогенов расположены на поверхности тела или в желудочно-кишечном тракте индивидуального насекомого очень важно, поскольку это может иметь эпидемиологические последствия и может привести к различным стратегиям по смягчению последствий. Как механическими переносчиками, летит эту землю на продукты питания в течение короткого времени может передавать только низкие уровни бактерий с их поверхности тела, в то время как те мухи, что пересказывают и дефекации на еду увеличить вероятность передачи патогенных микроорганизмов на потенциально более высокие уровни инфекции. Следовательно, важно оценить распространённость пищевого возбудителя по индивидуальному насекомых и дифференцировать часть тела этого насекомого, где бактериальная р athogen находится.
Даже если использование культуральных-независимых методов для обнаружения пищевых патогенов все чаще реализуется, они не были коммерчески используется для обнаружения пищевых патогенов из одного насекомого. В настоящее время проверяются молекулярные протоколов, которые имеются в продаже для быстрого обнаружения пищевых патогенов из продуктов, которые в настоящее время используется в промышленности и регулирующих органов. Эти методы включают в себя системы на основе ДНК для обнаружения возбудителей в различных образцах пищевых продуктов. Хотя молекулярные протоколы быстрее, чем традиционные методы металлизации, обогащение образца по-прежнему требуется, чтобы получить уровень чувствительности 10 2 колониеобразующих единиц (КОЕ) в бактериальным патогеном, необходимого в полимеразной цепной реакции (ПЦР) основе методов 19. Кроме того, выделение чистых бактериальных колоний от ПЦР-положительных образцов, чтобы подтвердить возбудителя с помощью соответствующих методов.
Содержание "> Целью этого протокола является стандартизация имеющихся в продаже, основанные на ПЦР систему, используемую для определения возбудителей от пищевых продуктов и проб окружающей среды для выявления пищевых бактерий с поверхности тела и желудочно-кишечного тракта одной лету и еще больше изолировать тех, патогены из чувствительности samples.The протокола, описанного здесь впервые откалиброван с лабораторными выращенных взрослых домашние мухи (Муха Доместикой), которые были экспериментально кормили с серийными разведениями каждого бактериального патогена. стандартизированный протокол был впоследствии использован для обследования 100 пойманных летит на наличие пищевых патогенов с их поверхностей тела и / или пищевых каналов. Это стандартизированный протокол позволит лаборатории общественного здравоохранения для выявления угроз для здоровья, связанных с насекомыми, допуская возможность сбора их как часть программы отбора проб окружающей среды при выполнении пищевого происхождения Исследования вспышек.Предыдущие исследования, которые выявляют пищевых патогенов от диких насекомых использовали большое разнообразие протоколов, которые не могут включать информацию, необходимую для точной оценки связанных с пищевыми продуктами риск наличия одного лету в пище или связанных с пищевыми продуктами условиях 13,15, 23,24. Здесь мы показали, что с помощью этого стандартизированного протокола, то можно обнаружить и изолировать Cronobacter SPP., С. enterica, Л. Monocytogenes с поверхности тела и желудочно-кишечного тракта отдельных мух, пойманных в дикой природе. Потому что насекомые могут нести низкие числа целевой пищевого возбудителя и большое число других коренных микрофлоры 25,26, этот протокол требует первичный (а иногда и вторичного) обогащение образцов в конкретных питательных сред для повышения чувствительности обнаружения целевой пищевого возбудителя , Результаты системы обнаружения на основе ПЦР были получены в течение примерно 30 ч (за DETEие из Cronobacter SPP. и С. enterica) и 48 ч (для обнаружения L. моноцитогенес) после первоначально обработки образцов. Таким образом, этот протокол является надежным, а также быстрое и достаточно чувствителен для выявления одного муху на наличие пищевых патогенов.
Подтверждение ПЦР-положительных результатов и изоляция жизнеспособных бактерий является частью стандартной операционной процедуры многих лабораториях. Кроме того, для целей эпидемиологии, чистые бактериальные культуры из ПЦР-положительных образцов должны дополнительно подтвердить и серотипа в пищевого происхождения патогена с использованием биохимических, иммунологических или генетических методов. Хотя не наблюдалось ложных срабатываний при обнаружении S. enterica и Л. моноцитогенес из частей тела отдельных пойманных мух, используя этот протокол, мы нашли до скорости ложных срабатываний для Cronobacter SPP 50%. Это говорит о том, что ПЦР-система обнаружения рода Cronobactэ может перекрестно реагировать с другими энтеробактерий присутствует среди весьма сложной микрофлоры осуществляется мухами. Таким образом, выделение и очистка из чистых колоний рода Cronobacter из ПЦР-положительных образцов требуют более селективное покрытие по сравнению с другими патогенами оцененных.
Данный протокол, прежде всего, были стандартизированы на экран отдельных пойманных мух на наличие Cronobacter SPP., С. enterica, Л. моноцитогенес используя коммерческую систему обнаружения на основе ПЦР. Тем не менее, этот протокол также легко адаптировать к экрану части тела отдельных мух на наличие других пищевых патогенов, таких как Энтерогеморрагическая кишечной палочки O157: H7 (либо с помощью кишечной палочки O157: H7 MP стандарт набора для анализа или кишечная палочка O157: H7 набор для анализа в режиме реального времени) и Шига-токсигенные E. палочки (STEC) группа (с использованием в режиме реального времени Стек Люкс), получение чувствительность> 80% (Отменить публикациюДанные ред). Кроме того, этот протокол потенциально могут быть приспособлены для обнаружения пищевых патогенов от других насекомых, которые, как известно, переносчики болезней (тараканов и муравьев), но больше исследований в этой области не требуется.
Болезни пищевого происхождения Исследования вспышек очень динамичны и включают в себя многоступенчатый процесс, который может меняться в зависимости от конкретной ситуации и локальное окружение расследуется 12,27. Эти исследования важны, потому что они обеспечивают мгновенную защиту общественного здравоохранения путем предотвращения будущих заболеваний. Кроме того, эти исследования могут пролить свет новые механизмы, с помощью которых распространяются пищевые микроорганизмы и поднимают важные вопросы, которые приводят к новым областям исследований 28. Методы расследования, а также стандартные, быстрые и чувствительные протоколы необходимы для обнаружения пищевых патогенов из отдельных насекомых. Это стандартизированный протокол открывает возможность асептически собирать насекомых, таких как мухи, WHICH могут вектора пищевых бактериальных патогенов, в рамках экологической программы отбора проб. Данные эпидемиологических исследований, которые могут быть получены из этого мог бы использоваться в построении точную картину о механизмах передачи пищевых патогенов насекомыми (например, длина Выдержка: муха на посадку по сравнению с мухами посадки, дефекации, и извергает).
Наконец, несмотря на то, коммерческая ПЦР-система обнаружения, описанный здесь, практичны в использовании и упрощает ПЦР-амплификации и визуализации родовой уровня ампликоне, это ни в коем случае не единственный соответствующую систему. Лизат из обогащенных образцов в качестве альтернативы может быть использован для скрининга на наличие пищевых патогенов с помощью общедоступных пары праймеров видоспецифической. Тем не менее, чувствительность обнаружения должна быть продемонстрирована до их использования.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Ben D. Tall, Yi Chen, and Thomas Hammak from the U.S. Food and Drug Administration (FDA), Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) for critically reviewing the manuscript. The authors also thank Hannah Lee (research internship program, Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition (JIFSAN), University of Maryland) for laboratory assistance and David Weingaertner (FDA, CFSAN) for preparing the figure of the schematic overview shown in the video.
Bismuth sulfite (BS) agar | Fisher Scientific | R452402 | *Multiple suppliers. |
Brain heart infusion (BHI) broth | Becton, Dickson and Company | 299070 | *Pre-warmed to 37°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Listeria agar (BLA) | Fisher Scientific | CM1080B | *Multiple suppliers. |
Buffered peptone water (BPW) | Becton, Dickson and Company | 212367 | *Pre-warmed to 37°C or 42°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen formulation/DFI) | Fisher Scientific | CM1055B | *Multiple suppliers. |
chromID Sakazakii Agar | bioMérieux | 43741 | *Call for information: 800.682.2666 |
R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Chromogenic Plating Medium | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
R & F Enterobacter sakazakiii Enrichment Broth and supplement | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
Hektoen enteric (HE) agar | Fisher Scientific | OXCM0419B | *Multiple suppliers. |
24 Listeria enrichment broth (24LEB) | Oxoid | CM1107 | *Freshly prepared at room-temperature. Multiple suppliers. |
Listeria selective enrichment supplement | Oxoid | SR0243 | *Multiple suppliers. |
Novobiocin | Fisher Scientific | OXSR0181E | *Multiple suppliers. Store at 2-8 °C |
Vancomycin hydrochloride hydrate | Sigma Aldrich | 861987 | Store at 2-8 °C |
Cefsulodin sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | C8145 | Store at 2-8 °C |
Rappaport-Vassiliadis (RV) medium | Fisher Scientific | CM0669B | *Multiple suppliers. |
Tetrathionate (TT) Broth | Becton, Dickson and Company | 249120 | *Multiple suppliers. |
Trypticase soy agar (TSA) | Becton, Dickson and Company | 236930 | *Multiple suppliers. |
Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar | Becton, Dickson and Company | 221284 | *Multiple suppliers. |
API Biochemical identification system | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2666 |
VITEK 2: Product Safety | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2667 |
BAX System Q7 | DuPont | N/A | |
BAX E. sakazakii Standard assay kit | DuPont | D11801836 | * |
BAX L. monocytogenes 24E assay kit | DuPont | D13608125 | * |
BAX Salmonella 2 Standard assay kit | DuPont | D14368501 | * |
Capping tool | DuPont | D11677028 | |
Decapping tool | DuPont | D11134095 | |
PCR tube rack/holder | DuPont | D12701663 | |
Featherweight forceps, wide tip | BioQuip | 4750 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Fine point, straight tip forceps | BioQuip | 4731 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Zirconia/silica beads, 0.5 mm | Bio Spec Products, Inc. | 11079105z | Multiple suppliers. |
Petri dishes – 60X15mm | Fisher Scientific | 08-772B | Multiple suppliers. |
Disposable inoculating loops, 10µL | Fisher Scientific | 22-363-606 | Multiple suppliers. |
L-shaped cell spreaders | Fisher Scientific | 14-665-230 | Multiple suppliers. |
Microcentrifuge tubes, 2 ml | Fisher Scientific | Various | Sterilize before use when needed. Secure lid is preferred. Multiple suppliers. |
Cluster tubes | Fisher Scientific | 05-500-13 | |
Cluster tubes caps | Fisher Scientific | 05-500-23 | |
Sodium hypochlorite (Liquid chlorine bleach) | N/A | N/A | *Dilute to 0.05% with water. Multiple suppliers. |
Sterile deionized water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Sterile distilled water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Ethyl alcohol 190 proof | N/A | N/A | *Dilute to 70% with water when needed. Multiple suppliers. |
Genie cell disruptor, 120V – for 1.5ml and 2.0ml microtubes | Scientific Industries, Inc. | SI-D238 | Multiple suppliers. |
Heating block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Cooling block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Recirculating water bath | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Stereo microscope | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Centrifuge | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Incubator | N/A | N/A | Multiple suppliers. |