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Environment

La detección de patógenos transmitidos por los alimentos bacteriana de moscas individual Filth

Published: February 13, 2015
doi:
10.3791/52372
, , ,
1Center for Food Safety and Applied Nutrition,U.S. Food and Drug Administration

Summary

A PCR-based protocol was adapted to detect Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes from body surfaces and alimentary canals of individual wild-caught flies. The goal of this protocol is to detect and isolate bacterial pathogens from individual insects collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations.

Abstract

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a particular foodborne illness outbreak has been challenging. This is because insects are not being aseptically collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations and because there is not a standardized method to detect foodborne bacteria from individual insects. To take a step towards solving this problem, we adapted a protocol from a commercially available PCR-based system that detects foodborne pathogens from food and environmental samples, to detect foodborne pathogens from individual flies.Using this standardized protocol, we surveyed 100 wild-caught flies for the presence of Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes and demonstrated that it was possible to detect and further isolate these pathogens from the body surface and the alimentary canal of a single fly. Twenty-two percent of the alimentary canals and 8% of the body surfaces from collected wild flies were positive for at least one of the three foodborne pathogens. The prevalence of Cronobacter spp. on either body part of the flies was statistically higher (19%) than the prevalence of S. enterica (7%) and L.monocytogenes (4%). No false positives were observed when detecting S. enterica and L. monocytogenes using this PCR-based system because pure bacterial cultures were obtained from all PCR-positive results. However, pure Cronobacter colonies were not obtained from about 50% of PCR-positive samples, suggesting that the PCR-based detection system for this pathogen cross-reacts with other Enterobacteriaceae present among the highly complex microbiota carried by wild flies. The standardized protocol presented here will allow laboratories to detect bacterial foodborne pathogens from aseptically collected insects, thereby giving public health officials another line of evidence to find out how the food was contaminated when performing foodborne outbreak investigations.

Introduction

Insectos juegan un papel importante en la transmisión de enfermedades relacionadas con los alimentos, ya que pueden propagarse patógenos a los alimentos o con las superficies y utensilios 1. Entre los insectos, moscas, cucarachas y hormigas exhiben comportamientos que favorecen la propagación de agentes patógenos transmitidos por los alimentos. Estos comportamientos incluyen una asociación con la materia en descomposición, basura y heces, (edificios) que entran endofilia y synanthropy (convivir con los humanos) 2. .. Los patógenos transmitidos por los alimentos, como Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp, Escherichia coli O157: H7, y los miembros del género Cronobacter (antiguamente Enterobacter sakazakii) se han notificado a ser transmitida por insectos 3-5. Suciedad sinantrópicas moscas mecánicamente extendió bacterias transmitidas por los alimentos mediante la transferencia de patógenos de sus superficies corporales contaminados. Sin embargo, la presencia de patógenos transmitidos por los alimentos en el tubo digestivo de las moscas puede ser hasta tres vecesmayor que la observada en sus superficies del cuerpo (cuerpo, la cabeza, las piernas y alas) 5. Patógenos transmitidos por alimentos también pueden permanecer en canal alimentario de la mosca para una mayor longitud de tiempo que en la superficie del cuerpo 6,7 y en algunos casos, que son capaces de multiplicarse, colonizando 4,8,9 tracto digestivo de la mosca. Esto aumenta el potencial vector de las moscas, ya que pueden extenderse más patógenos transmitidos por alimentos a través de la defecación y la regurgitación 10,11.

Hoy en día, hay mejores sistemas de vigilancia que son capaces de detectar los brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos con mayor rapidez. Durante la realización de investigaciones de brotes de origen alimentario, los funcionarios de salud pública buscan el alimento que puede ser la fuente (s) o vehículo (s) de la infección. Los investigadores también pueden realizar una evaluación ambiental de la instalación (o instalaciones) que participan para averiguar cómo se contaminó la comida y pueden recoger muestras como parte de la investigación 12. Despite la gran cantidad de literatura científica acerca de los insectos como portadores de agentes patógenos transmitidos por los alimentos, la vinculación de los insectos como vectores del patógeno causando un brote de enfermedades transmitidas por alimentos en particular ha sido un reto. Esto es principalmente porque los insectos no están siendo recogidos asépticamente como parte de los programas de muestreo ambiental durante las investigaciones de brotes de origen alimentario. Para incluir insectos, en particular aquellos que exhiben comportamientos que favorecen la propagación de agentes patógenos transmitidos por los alimentos, como parte de un procedimiento de toma de muestras ambientales, un protocolo estandarizado, rápida, sensible y fiable para detectar agentes patógenos transmitidos por los alimentos de un solo insecto tiene que estar en su lugar.

Técnicas de chapado tradicionales para la detección de patógenos transmitidos por los alimentos de los insectos son laboriosos y dependen del crecimiento competitivo de las bacterias diana en diferentes medios de cultivo para superar el rápido crecimiento de la microbiota comensal innata del insecto. La mayoría de los estudios que se han asociado con los insectos bapatógenos cterial han aumentado la sensibilidad del método por la puesta en común juntos varios insectos en lugar de identificar la presencia de patógenos en una base por individuo. Por lo tanto, esos estudios no diferencian la parte del cuerpo del insecto donde se encontraron los patógenos 13-18. La capacidad de identificar si los patógenos alimentarios se encuentran en la superficie corporal o en el tubo digestivo de un insecto individual es importante, ya que esto puede tener implicaciones epidemiológicas y puede dar lugar a diferentes estrategias de mitigación. Como vectores mecánicos, las moscas que se posan en los alimentos durante un corto tiempo sólo podrán transferir los niveles bajos de bacterias de su superficie corporal, mientras que aquellas moscas que regurgitan y defecar en la comida de aumentar la probabilidad de transferencia de patógenos a niveles potencialmente altos de infección. En consecuencia, es importante para estimar la prevalencia de un patógeno de transmisión alimentaria por un insecto individual y para diferenciar la parte del cuerpo de ese insecto donde el p bacteriana athogen se encuentra.

A pesar de que cada vez más se están implementando el uso de métodos independientes del cultivo para detectar agentes patógenos transmitidos por los alimentos, que no se han utilizado comercialmente para detectar agentes patógenos transmitidos por los alimentos de un solo insecto. Actualmente, no se validan protocolos moleculares que están disponibles comercialmente para la detección rápida de patógenos transmitidos por los alimentos de los alimentos que están siendo utilizados por la industria y los organismos reguladores. Estos métodos incluyen sistemas basados ​​en ADN para la detección de patógenos en una variedad de muestras de alimentos. Aunque los protocolos moleculares son más rápidos que los métodos tradicionales de galvanoplastia, el enriquecimiento de la muestra aún se requiere para obtener el nivel de sensibilidad de 10 2 unidades formadoras de colonias (UFC) de los patógenos bacterianos necesario en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Métodos basados ​​en 19. Además, se necesita el aislamiento de colonias bacterianas puras a partir de muestras positivas por PCR para confirmar el patógeno mediante métodos adecuados.

contenido "> El objetivo de este protocolo es estandarizar un sistema basado en la PCR disponible comercialmente usado para detectar patógenos en muestras alimentarias y ambientales para la detección de bacterias transmitidas por los alimentos a partir de la superficie del cuerpo y el tubo digestivo de una sola mosca y aislar aún más a los patógenos de la sensibilidad samples.The del protocolo descrito aquí se calibró primero con la casa de adultos criados en el laboratorio moscas (Musca domestica) que fueron alimentados experimentalmente con diluciones en serie de cada patógeno bacteriano. El protocolo estandarizado se utilizó posteriormente para estudiar 100 silvestre moscas de la presencia de agentes patógenos transmitidos por los alimentos de sus superficies corporales y / o tubos digestivos. Este protocolo estandarizado permitirá laboratorios de salud pública para la detección de amenazas para la salud que plantean los insectos, lo que permite la posibilidad de proceder a su recogida como parte del programa de muestreo ambiental al realizar transmitidas por los alimentos investigaciones de brotes.

Protocol

1. Recopilación de las moscas Recoger moscas individuales utilizando redes de barrido entomológicos estériles. Ponga las redes en una hielera y transferirlos al laboratorio. 2. Disección de Moscas Inmovilizar moscas recolectadas asépticamente colocándolos a -20 ° C durante 5-7 min. Con unas pinzas estériles lugar una mosca en un tubo de 2 ml estéril que contiene 1 ml de pre-calentado (37 ° C) agua de peptona tamponada (BPW). Mezclar el tubo suavemente por inversión durante 2 min. Es esencial que todo el cuerpo de la mosca de estar en contacto con los medios de comunicación de manera que la microbiota presente en la superficie del cuerpo (S) de la mosca se transferirá a la BPW (BPW-S). Etiquetar el tubo con un número y parte del cuerpo de la mosca (es decir, 1S). NOTA: Por favor consulte la Tabla de Reactivos / Equipos específicos para una descripción detallada de los materiales y reactivos mencionados en este protocolo. Con unas pinzas estériles erradicar la mosca de los medios de comunicación y transferencia de BPW-Sa un tubo de 2 ml vacía y limpia a la superficie a desinfectar la marcha. Incubar el tubo que contiene los medios de comunicación BPW-S a 37 ° C mientras se realiza el protocolo de desinfección y disección. Surface-desinfectar la marcha por inmersión en 1 ml de etanol al 70% durante 1 min, seguido de un enjuague con agua destilada estéril antes de introducirlos en 1 ml recién preparada de 0,05% (v / v) solución de lejía. Enjuagar 3 veces con agua destilada estéril. Transferencia de agua del último aclarado a un tubo en autoclave 2 ml. NOTA: Deseche el líquido cada vez utilizando una micropipeta 1000 l o invirtiendo el tubo, asegurándose de que la mosca se mantiene en el interior del tubo. Mezclar suavemente por inversión en cada paso del proceso de la superficie-desinfección. Para evaluar la eficacia del proceso de desinfección, transferir 100 l de agua del último aclarado a una placa de agar tripticasa de soja (TSA) y se extendió usando un esparcidor desechable en forma de L estéril. Incubar la placa a 37 ° C durante 24 horas. Después enincubación, registrar la presencia de cualquier colonia bacteriana. Nota: La presencia de colonias bacterianas en las placas de TSA indica un proceso superficie desinfección ineficiente. Si esto ocurre, la presencia de agentes patógenos transmitidos por los alimentos solo debe ser informado sobre la superficie del cuerpo de la mosca porque la contaminación cruzada entre la superficie del cuerpo y el tubo digestivo no puede ser descartada. Después de la desinfección de la superficie de la mosca, la transferencia a un trozo de toalla de papel en autoclave para eliminar el exceso de agua y luego a un 60 mm desechable placa de Petri estéril. Coloque la placa de Petri bajo un microscopio de disección y determinar la marcha a nivel de especies utilizando claves dicotómicas para familias dípteros 20,21. Con unas pinzas de punta fina en autoclave tire suavemente el ano y todo el tubo digestivo (A) de la marcha y de forma aséptica ceda a otro tubo de 2 ml estéril que contiene 1 ml de pre-calentado (37 ° C) BPW con 0,5 mm de zirconia / sílice perlas (BPW-A). º Labele tubo con el mismo número seleccionado para la mosca individual y la parte del cuerpo de la mosca (es decir, 1A). Mezclar el tubo que contiene la BPW-A a fondo durante 5 a 10 min usando un disruptor celular. Incubar a 36 ± 1 ° C mientras se realiza el resto del protocolo. Para bono y / o almacenar la muestra para largo plazo, colocar el resto de la mosca en un tubo de 2 ml limpio y añadir 1 – 2 ml de etanol al 95%. 3. Enriquecimiento Primaria y Secundaria Etiquetar todos los tubos de enriquecimiento primaria y secundaria que contienen los medios de comunicación de acuerdo con el número de muestra y la parte del cuerpo de la mosca. Bajo una campana estéril, transferir 300 l de BPW-S (superficie) de estériles de 2 ml tubos que contienen los siguientes medios: Para Salmonella, utilizar 1 ml de pre-calentado (42 ° C) BPW. Incubar en un baño de agua de recirculación a 42,5 ° C durante 22-24 horas. Para el enriquecimiento secundario, transferir 100 l de BPW enriquecido a 400 & #181; l de pre-calentado (37 ° C) de infusión cerebro corazón (BHI) colocado previamente en tubos estériles de racimo. Se incuba a 37 ° C durante 3 horas. Para Cronobacter, utilizar 1 ml de pre-calentado (37 ° C) BPW con novobiocina (10 mg / L; Wallace, M., comunicación personal). También puede utilizar 1 ml de la R & F Enterobacter sakazakii caldo de enriquecimiento con suplemento (vancomicina y cefsulodina) como enriquecimiento primario. Se incuba a 37 ° C durante 22-26 horas. Para el enriquecimiento secundario, transferir 100 l de agua de peptona tamponada enriquecido con novobiocina a 400 l de pre-calentado (37 ° C) BHI caldo previamente colocados en tubos estériles de racimo. Se incuba a 37 ° C durante 3 horas. Para L. monocytogenes, use 1 ml de recién preparada RT 24 Listeria caldo de enriquecimiento (24 LEB) con suplemento selectivo. Se incuba a 37 ° C durante 44 ± 5 ​​horas. No se requiere un enriquecimiento secundario para la detección de L. monocytogenes. </li> Repita los pasos 3.2.1 – 3.2.3 usando el tubo rotulado como BPW-A. 4. Preparación del sistema basado en PCR para la amplificación y detección de la diana de Transmisión Alimentaria de patógenos Los pasos 4-8 utilizan un sistema comercial PCR ciclador / detector, una estación de trabajo de ordenador, y kits de usar listos para la detección de Salmonella (Salmonella 2 kit de ensayo estándar), especie de Cronobacter (E. sakazakii kit de ensayo estándar), y Listeria monocytogenes (L. monocytogenes kit de ensayo 24E). Ensayos estándar utilizan detección del punto final PCR. Cada kit contiene tabletas PCR-listos con un colorante intercalante que emite una señal de fluorescencia cuando se unen al DNA de doble cadena. Se captura la señal durante la fase de detección del programa del sistema de PCR, lo que genera una curva de fusión que es interpretado por el software como positivo o negativo. Preparar reactivos y equipos especificados por el fabriprotocolo de rer por cada patógeno alimentario objetivo. NOTA: Los protocolos para la detección de Salmonella y Cronobacter requieren un procedimiento de lisis de un solo paso mientras que el protocolo para la detección de L. monocytogenes requiere un procedimiento de lisis de dos etapas (ver las secciones 5 y 6, respectivamente). Encienda el bloque de calentamiento automático seleccionando el programa específico para el patógeno diana. Alternativamente, si los bloques de calentamiento son manuales, establecer las temperaturas hasta 37 ° C (por Salmonella, Cronobacter spp y L. monocytogenes.) O hasta 55 ± 2 ° C (para L. monocytogenes parte 2 de lisis – consulte el paso 6.2) y 95 ± 3 ° C. Asegúrese de que los bloques de refrigeración han sido refrigerados S / N, de lo contrario enfriarlos a 2 – 8 ° C durante al menos 2 horas. Utilizando el software de ordenador del sistema de detección basado en la PCR, crear un archivo de bastidor siguiendo las instrucciones del fabricante. Etiquetar y organizar clústertubos que contiene el reactivo de lisis en el bastidor, de acuerdo con el archivo de rack. Inicializar el instrumento sistema de detección basado en la PCR. 5. Realice lisis para la detección de Salmonella y Cronobacter Preparar el reactivo de lisis mediante la adición de 150 l de proteasa para una botella de 12 ml de tampón de lisis. Transferir 200 l de reactivo de lisis a cada uno de los tubos de racimo previamente etiquetados. NOTA: Los tubos de racimo que contienen el reactivo de lisis pueden conservarse a 2-8 ° C durante un máximo de 2 semanas. Utilizando puntas largas pipeta, transferir 20 l de muestras enriquecidas secundarios (consulte los pasos 3.2.1 y 3.2.2) a que corresponde tubos de racimo que contenían 200 l de reactivo de lisis. Emplee una punta para cada muestra. NOTA: Mantenga los tubos de enriquecimiento de primaria y secundaria en el refrigerador (Salmonella) o en RT (Cronobacter) para su posterior análisis de confirmación de las muestras de PCR-positivo / negativo. </li> Preparar controles negativos añadiendo 20 l de medios BHI estéril para tubos de racimo que contenían 200 l de reactivo de lisis. Preparar controles positivos añadiendo 20 l de S / N cultivos bacterianos (cultivados en BHI) de cualquier Salmonella conocido o tensión Cronobacter a tubos de racimo contienen 200 l de reactivo de lisis. Tubos de racimo Cap y asegurar firmemente el uso de la herramienta de nivelación. Coloque la parrilla de tubos de racimo en el bloque de calentamiento automático después de seleccionar el programa específico para el patógeno diana. Alternativamente, se incuban los tubos de racimo a 37 ± 2 ° C durante 20 min, seguido de incubación a 95 ± 3 ° C durante 10 min. Por último, la transferencia de los tubos de racimo a los bloques de refrigeración (2-8 ° C) durante 5 min. NOTA: Los tubos de racimo contienen el lisado se pueden almacenar a -20 ° C durante un máximo de 2 semanas. 6. Realizar lisis para la detección de L. monocytogenes Realizar la primera parte dede lisis como sigue: Añadir 1,8 ml de agua desionizada estéril a la botella de agente de lisis completamente descongelado 1. NOTA: Tienda agente 1 lisis a 2 – 8 ° C hasta su utilización. Después de la apertura y de dilución, almacenar a temperatura ambiente (20 – 30 ° C) durante un máximo de 6 meses. Combinar agentes de lisis de 1 y 2 en una proporción de 4: 1 (40 l de agente de lisis diluido 1 y 10 l de agente de 2 por cada muestra de lisis). Transferencia de 50 l de los agentes de lisis se combinaron para agrupan tubos. Utilizar la mezcla dentro de 4 horas. Añadir 500 l de muestra enriquecida primario (véase el paso 3.2.3) para el tubo de clúster que contiene los 50 l de los agentes de lisis combinados. Preparar un control negativo mediante la adición de 500 l de 24 LEB estéril para 50 l de los agentes de lisis combinados. Preparar un control positivo por adición de 500 l de O / N L. cultura monocytogenes cultiva en 24 LEB a 50 l de los agentes de lisis combinados. Tapar los tubos de racimo, mezclar suavemente y lugaren el bloque de calentamiento a 37 ± 1 ° C durante 30 min. NOTA: Mantenga los tubos de enriquecimiento primario en el refrigerador para su posterior análisis de confirmación de las muestras de PCR-positivo / negativo. Realizar la parte 2 de lisis como sigue: Preparar el reactivo de lisis como se indica en los pasos 5.1 y 5.2. Utilizando puntas largas pipeta de transferencia 20 l de la primera parte lisado a tubos de racimo que contenían 200 l de reactivo de lisis. Emplee una punta para cada muestra. Tubos de racimo Cap y asegurar firmemente el uso de la herramienta de nivelación. Coloque los tubos de racimo en el bloque de calentamiento automático seleccionando el programa específico de L. monocytogenes. Alternativamente, Incubar los tubos en racimo en 55 ± 2 ° C durante 30 min, seguido de incubación a 95 ± 3 ° C durante 10 min. Por último, la transferencia de los tubos de racimo a los bloques de refrigeración (2-8 ° C) durante 5 min. NOTA: Los tubos de racimo contienen el lisado se pueden almacenar a -20 ° C durante un máximo de 2 semanas. Tabletas 7. Hidratación PCR-Ready Seleccionar un (4 ° C) bloque de enfriamiento refrigerados PCR y colocar un bastidor de tubo de PCR sobre el inserto. Coloque correspondientes tubos de PCR que contienen las pastillas PCR-listas (incluidas con cada kit) para el patógeno alimentario objetivo en el soporte, de acuerdo con el archivo de rack. Con la herramienta decapping, retire con cuidado las tapas de los tubos de PCR. Deseche los tapones y compruebe que cada tubo contiene una tableta. Transferencia de 50 l (por Salmonella y Cronobacter) o 30 l (por L. monocytogenes) de lisado de tubos de PCR específicos. Utiliza las nuevas tapas ópticas y asegurar firmemente sobre los tubos de PCR utilizando la herramienta de nivelación. NOTA: Después de añadir el lisado a las tabletas-PCR listo, las muestras debe permanecer refrigerado a 2 – 8 ° C hasta que esté cargada en el sistema de detección basado en PCR. Los tubos de PCR se pueden centrifugaron a 2500 xg durante unos pocos segundos para asegurar que el volumen completo se encuentra en la parte inferior tél tubo. Cargue los tubos de PCR en el instrumento del sistema de ciclos / detección por PCR abriendo el cajón instrumento. Coloque la parrilla de tubos de PCR en los pozos en el cajón y comprobar que los tubos están colocados correctamente. Cierre el cajón e iniciar el programa como se describe en el protocolo del fabricante. NOTA: El instrumento basado en la PCR ha preestablecido ciclismo parámetros para cada patógeno alimentario. Verifique que la barra de estado de ciclo de PCR muestra una barra azul que indica que la porción de amplificación de la ejecución del programa. NOTA: Para los ensayos de PCR estándar, el tiempo de procesamiento del programa completo (amplificación y detección) tarda aproximadamente 3 a 3,5 horas en completarse. 8. Revisión de los resultados Después de finalizar el proceso, siga las instrucciones en pantalla del instrumento sistema basado en PCR para extraer muestras y resultados de la revisión. Si el patógeno alimentario diana está presente en la muestra (ya sea elsuperficie o el tubo digestivo de la mosca) el pozo es de color rojo con un signo "más" (positivo). Si el patógeno está ausente, el pozo es de color verde con un signo "menos" (negativo). Si el pozo es de color amarillo con una barra roja en el centro, indica un error de señal. 9. El aislamiento de patógenos bacterianos de Resultados PCR-positivos Seleccione tubos de la primaria (de L. monocytogenes) o secundaria (para Salmonella y Cronobacter) el enriquecimiento de esas muestras que fueron PCR-positivo. Además, seleccione al azar 3-5% de las muestras que fueron PCR-negativo y proceder como sigue: Para Salmonella: Añadir 100 l de los medios de comunicación de enriquecimiento secundario a 10 ml de Rappaport-Vassiliadis (RV) a medio y a 1 ml de tetrationato (TT) caldo. Incubar los tubos a 42,5 ° C en un baño de agua de recirculación para 22 a 24 h. Después de la incubación, veta un asa 3 mm (10 l) de cada uno, un RVd TT medios de sulfito de bismuto (BS) agar, desoxicolato xilosa lisina (XLD) agar, y Hektoen entérica (HE) agar. Incubar las placas a 35 ± 1 ° C durante 22-24 horas. Después de la incubación, las placas para examinar la presencia de colonias típicas de Salmonella en cada medio. Si no hay colonias aisladas se pueden obtener después de varios pasos sub-cultivo, considerar la muestra como negativo y reportar como un falso positivo para el sistema basado en PCR. NOTA: Para las colonias típicas de Salmonella en medios específicos ver 22. Seleccionar cinco colonias de Salmonella típicos presuntivos y la subcultura ellos en BS, XLD, o HE hasta obtener cultivos puros de colonias aisladas / individuales. Seleccione una colonia pura e identificar Salmonella presuntiva usando pruebas bioquímicas comerciales tales como la tarjeta de identificación VITEK 2 o API del sistema de identificación bioquímica, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para Cronobacter: <ol> Streak un asa 3 mm (10 l) de los medios de enriquecimiento secundario en dos placas de medios de cultivo cromogénicos tales como sakazakii R & F Enterobacter (Cronobacter) medio en placa cromogénico, y / o chromID sakazakii Agar. Incubar las placas a 35 ° C durante 22-24 horas. Después de la incubación, las placas para examinar la presencia de colonias de Cronobacter típicos (azul-negro a azul-gris). Seleccione 5 colonias de Cronobacter presuntivos y la subcultura ellos en sakazakii R & F Enterobacter (Cronobacter) medio en placa cromogénico, chromID sakazakii agar, o TSA hasta la obtención de cultivos puros de colonias aisladas / individuales. NOTA: Si no hay colonias aisladas se pueden obtener después de varios pasos sub-cultivo, considere la muestra como negativo y reportar como un falso positivo para el sistema de detección basado en la PCR. Seleccionar una colonia pura e identificar Cronobacter presuntiva mediante el uso de commer bioquímicapruebas oficiales tales como la tarjeta de identificación VITEK 2 o API 20E sistema de identificación bioquímica, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para L. monocytogenes: Streak un asa 3 mm (10 l) de los medios de enriquecimiento primario en dos placas de agar Brilliance, Listeria (BLA). Incubar las placas a 36 ± 1 ° C durante 22-26 horas. Después de la incubación, las placas para examinar la presencia de L. presuntiva monocytogenes (azul-verde) colonias. Seleccione 5 presunto L. monocytogenes colonias y subcultura ellos en BLA hasta obtener cultivos puros de colonias aisladas / individuales. Vuelva a incubar las placas negativas a 36 ± 1 ° C durante otros 22 a 26 h. Seleccionar una colonia pura e identificar presuntiva L. monocytogenes mediante pruebas bioquímicas comerciales, tales como la tarjeta de identificación VITEK 2 o API del sistema de identificación bioquímica Listeria, siguiendo i del fabricanterecauciones. Patógenos alimentarios presuntivos aislados de insectos deben ser confirmados más y serotipificadas en un laboratorio de referencia.

Representative Results

Este protocolo se calibró primero en un conjunto de moscas domésticas criados en el laboratorio que fueron alimentados experimentalmente para 24 horas con alimento líquido mosca (leche en polvo 2%) que contenía diluciones en serie (02 10 hasta agosto 10 CFU / ml) de C. sakazakii, S. enterica, L. monocytogenes, o C. jejuni (n = 21 para cada patógeno bacteriano). Los medios de enriquecimiento así como los tiempos y temperaturas de incubación se ajustaron para cada patógeno alimentario hasta que el sistema basado en la PCR fue capaz de detectar los niveles más bajos de bacterias (10 2 CFU / ml) de la superficie del cuerpo y el tubo digestivo de un solo experimentalmente alimentado volar. El uso de los medios de enriquecimiento y condiciones descritos en la sección de protocolo, el sistema basado en la PCR detectó C. sakazakii, S. enterica, y L. monocytogenes a partir de la superficie del cuerpo del 100% de las moscas alimentadas con inóculos> 10 3 UFC / ml de bacterias (Figura 1A). Cuando se alimentó a las moscas con 102 CFU / ml, el porcentaje de detección de C. sakazakii, S. enterica, y L. monocytogenes a partir de su superficie corporal fue del 100%, 66% y 33%, respectivamente (Figura 1A). El sistema basado en la PCR también detectó estos tres agentes patógenos transmitidos por los alimentos desde el tubo digestivo de las moscas alimentadas con todas las concentraciones de bacterias en porcentajes ≥33% (Figura 1B). Sin embargo, la detección de C. jejuni sólo se logra cuando las moscas criados en el laboratorio fueron alimentados experimentalmente con alimento líquido que contiene el inóculo bacteriano más alto (10 8 UFC / ml). Por lo tanto, C. jejuni fue excluido del grupo de patógenos transmitidos por alimentos que podrían ser a prueba de suciedad sinantrópica individuo moscas usando este sistema de detección basado en la PCR. Con este protocolo estandarizado, hemos sido capaces de determinar la prevalencia de Cronobacter spp., S. enterica, y L. monocytogenes a partir de la superficie y / o cuerpo ºe canal alimentario de 100 moscas silvestres que eran individualmente y de forma aséptica atrapados desde el área de basurero de diez restaurantes urbanos ubicados en el área metropolitana de Washington, DC 5 moscas filth recogidas fueron representativos de al menos seis especies incluyendo M. domestica (47%), Lucilia cuprina (33%), L. sericata (14%), Cochliomyia macellaria (2%), Sarcophaga haemorrhoidalis (2%), y Ophyra leucostoma (1%). Se identificó un mosca sólo a nivel de familia (Anthomyiidae; 1%). El protocolo de desinfección de superficie fue eficaz a evitar la contaminación cruzada entre las partes del cuerpo de la mosca porque no hay crecimiento bacteriano se observó en placas TSA para el agua del último aclarado desinfección de cada mosca individual. Por lo tanto, una distinción podría hacerse entre las bacterias transmitidas por los alimentos presentes en las partes del cuerpo de cada mosca. No hay falsos positivos se detectaron en las muestras de la superficie del cuerpo y el tubo digestivo demoscas individuales cuando se utiliza este sistema basado en PCR comercial para la detección de S. enterica y L. monocytogenes, y la confirmación de patógenos viables en placas de agar estaba de acuerdo con los resultados de PCR positivos. Sin embargo, no fue posible aislar cultivos puros de Cronobacter spp. de todas las muestras PCR-positivos. Por lo tanto, la detección de este patógeno por la PCR basa- sistema mostró falsos positivos de la superficie del cuerpo (50%; 9/18) y el tubo digestivo (48%; 16/33) de las moscas silvestres individuales. Muestras-PCR negativo seleccionados al azar que se sembraron en medios de comunicación específicos, confirmaron la ausencia de los agentes patógenos transmitidos por los alimentos. Por lo tanto, no hay falsos negativos se detectaron a partir de ninguna de las muestras cuando se utiliza este sistema basado en PCR comercial para detectar Cronobacter spp., S. enterica, o L. monocytogenes. Sólo aquellas muestras PCR-positivos donde se aisló el patógeno y confirmó fueron considerados positivose incluidos para el análisis estadístico. La presencia global de los patógenos transmitidos por los alimentos en el tubo digestivo de las moscas filth capturados en la naturaleza fue significativamente mayor que en la superficie del cuerpo (χ 2 = 6,8772, df = 1, p = 0,0087). 22% de los canales alimentarios y 8% de las superficies del cuerpo de las moscas silvestres recogidos fueron positivas para al menos uno de los tres patógenos transmitidos por los alimentos (Figura 2). En general, la prevalencia de Cronobacter spp. en cualquiera de las superficies del cuerpo o tubos digestivos de moscas recolectadas fue estadísticamente más alta (19%; la prueba exacta de Fisher p = 0,0165) que la prevalencia de S. enterica (7%) y L. monocytogenes (4%). Sin embargo, no se observaron diferencias estadísticas al realizar las comparaciones por pares entre las partes del cuerpo de las moscas para cada patógeno bacteriano (Figura 3; prueba exacta de Fisher p = 0,1464, p = 0,1184, p = 0,6212 y para Cronobacterspp., S. enterica, y L. monocytogenes, respectivamente). Ninguna de las moscas fueron positivos para los tres patógenos evaluados. Sin embargo, tres de las moscas (dos L. cuprina y uno L. sericata) llevado a Salmonella spp. y L. monocytogenes en la superficie o en el tubo digestivo. Figura 1. Niveles de detección de Cronobacter sakazakii, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, y Campylobacter jejuni de (A) la superficie del cuerpo y (B) del canal alimentario de moscas domésticas criados en el laboratorio individuales alimentados con alimentos líquidos que contienen diferentes inóculos bacterianos (n = 21 para cada patógeno bacteriano, n = 3 por cada concentración bacteriana). <img alt="Figura 2"src = "/ files / ftp_upload / 52372 / 52372fig2.jpg" /> Figura 2. Porcentaje de la superficie del cuerpo y tubos digestivos de moscas individuales den positivo para cualquiera de los patógenos transmitidos por los alimentos de destino. Figura 3. Prevalencia de Cronobacter spp., Salmonella enterica y Listeria monocytogenes a partir de la superficie del cuerpo y el tubo digestivo de las moscas silvestres capturados sinantrópicas. Los valores p reportados son de las comparaciones por pares entre la superficie del cuerpo y el tubo digestivo para cada patógeno bacteriano (prueba exacta de Fisher, valor de p <0,05 indica significación estadística). Copyright © Sociedad Americana de Microbiología, Journal of Applied and Environmental Microbiology 78 (22): 7891-902, 2012. doi: 10.1128 / AEM.02195-12.

Discussion

Estudios previos que han detectado los patógenos alimentarios de insectos silvestres han utilizado una gran variedad de protocolos que podrían no incluir la información necesaria para evaluar con precisión el riesgo relacionado con la comida de la presencia de una sola mosca en los alimentos o en entornos relacionados con la alimentación, 13,15 23,24. Aquí, hemos demostrado que el uso de este protocolo estandarizado, es posible detectar y aislar Cronobacter spp., S. enterica, y L. monocytogenes a partir de la superficie del cuerpo y el tubo digestivo de las moscas individuales capturados en el medio silvestre. Dado que los insectos pueden llevar a un bajo número de patógeno de transmisión alimentaria objetivo y un alto número de otra microbiota indígena 25,26, este protocolo requiere enriquecimiento primario (y, a veces secundario) de las muestras en medios de cultivo específicos para aumentar la sensibilidad de la detección del patógeno alimentario objetivo . Los resultados del sistema de detección basado en la PCR-se obtuvieron dentro de aproximadamente 30 horas (para la detección de Cronobacter spp. y S. enterica) y 48 h (para la detección de L. monocytogenes) inicialmente después de procesar las muestras. Por lo tanto, este protocolo es fiable, así como un rápido y lo suficientemente sensibles como para detectar una sola mosca de la presencia de agentes patógenos transmitidos por los alimentos.

Confirmación de los resultados de PCR positivos y el aislamiento de bacterias viables es parte del procedimiento operativo estándar de muchos laboratorios. Además, para los propósitos de epidemiología, se requieren cultivos bacterianos puros de las muestras positivas por PCR para confirmar aún más y el serotipo del patógeno transmitidas por los alimentos usando bioquímicos, inmunológicos, o métodos genéticos. Aunque no se observaron falsos positivos en la detección de S. enterica y L. monocytogenes de las partes del cuerpo de las moscas silvestres capturados individuales, el uso de este protocolo, se encontraron a una tasa de 50% de falsos positivos para Cronobacter spp. Esto sugiere que el sistema de detección basado en la PCR-para el género Cronobacter pueden reaccionar de forma cruzada con otras enterobacterias presentes entre la microbiota muy complejo realizado por las moscas. Por lo tanto, el aislamiento y la purificación de colonias puras del género Cronobacter partir de muestras de PCR-positivos requieren chapado más selectivo que los otros patógenos evaluados.

Este protocolo principalmente se ha estandarizado para detectar moscas silvestres capturados individuales para la presencia de Cronobacter spp., S. enterica, y L. monocytogenes utilizando un sistema de detección basado en la PCR comercial. Sin embargo, este protocolo también se adapta fácilmente para detectar partes del cuerpo de moscas individuales para la presencia de otros patógenos transmitidos por los alimentos, tales como E. coli enterohemorrágica O157: H7 (utilizando el E. coli O157: H7 kit de ensayo estándar de MP o la E. coli O157: H7 kit de ensayo en tiempo real) y el shiga toxigénica E. coli (STEC) grupo (mediante el paquete de STEC en tiempo real), sensibilidades obteniendo> 80% (despublicardatos ed). Además, este protocolo puede potencialmente ser adaptado para detectar agentes patógenos transmitidos por los alimentos de otros insectos que son vectores de enfermedades (cucarachas y hormigas) conocidos, pero se necesita más investigación en esta área.

Las investigaciones de brotes enfermedades transmitidas por alimentos son muy dinámicos y comprenden un proceso de varios pasos que pueden variar en función de la situación específica y el medio ambiente local siendo investigados 12,27. Estas investigaciones son importantes porque proporcionan inmediata protección de la salud pública mediante la prevención de futuras enfermedades. Además, estas investigaciones pueden dilucidar nuevos mecanismos por los cuales los microorganismos transmitidos por los alimentos se reparten, y plantear preguntas importantes que conducen a nuevas áreas para la investigación 28. Las técnicas de investigación, así como los protocolos estandarizados, rápidas y sensibles son necesarios para la detección de patógenos transmitidos por los alimentos de insectos individuales. Este protocolo estandarizado abre la oportunidad de recoger asépticamente insectos como moscas, which pueden vector del patógeno bacteriano transmitidas por los alimentos, como parte de un programa de muestreo ambiental. La información epidemiológica que se pueden obtener de esto sería de utilidad en la construcción de una imagen precisa de los mecanismos de transmisión de microorganismos patógenos por insectos (por ejemplo, la duración del tiempo de exposición: una mosca por el aterrizaje contra moscas aterrizar, defecar, y regurgitando).

Finalmente, a pesar de que el sistema de detección basado en la PCR comercial descrito aquí es práctico de usar y simplifica amplificación por PCR y la visualización de un amplicón nivel de género, no es de ninguna manera el único sistema apropiado. El lisado de las muestras enriquecidas alternativamente podría ser utilizado para la detección de la presencia de agentes patógenos transmitidos por los alimentos mediante el uso de pares de cebadores específicos de especie públicamente disponibles. Sin embargo, la sensibilidad de detección debe demostrarse antes de su uso.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thanks to Ben D. Tall, Yi Chen, and Thomas Hammak from the U.S. Food and Drug Administration (FDA), Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) for critically reviewing the manuscript. The authors also thank Hannah Lee (research internship program, Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition (JIFSAN), University of Maryland) for laboratory assistance and David Weingaertner (FDA, CFSAN) for preparing the figure of the schematic overview shown in the video.

Materials

Bismuth sulfite (BS) agar Fisher Scientific R452402 *Multiple suppliers.
Brain heart infusion (BHI) broth Becton, Dickson and Company 299070 *Pre-warmed to 37°C. Multiple suppliers.
Brilliance Listeria agar (BLA) Fisher Scientific CM1080B *Multiple suppliers.
Buffered peptone water (BPW) Becton, Dickson and Company 212367 *Pre-warmed to 37°C or 42°C. Multiple suppliers.
Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen formulation/DFI) Fisher Scientific CM1055B *Multiple suppliers.
chromID Sakazakii Agar bioMérieux 43741 *Call for information: 800.682.2666
R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Chromogenic Plating Medium R & F Laboratories Various *Call for information: +1.630.969.530
R & F Enterobacter sakazakiii Enrichment Broth and supplement R & F Laboratories Various *Call for information: +1.630.969.530
Hektoen enteric (HE) agar Fisher Scientific OXCM0419B *Multiple suppliers.
24 Listeria enrichment broth (24LEB) Oxoid CM1107 *Freshly prepared at room-temperature. Multiple suppliers.
Listeria selective enrichment supplement Oxoid SR0243 *Multiple suppliers.
Novobiocin Fisher Scientific OXSR0181E *Multiple suppliers. Store at 2-8 °C
Vancomycin hydrochloride hydrate Sigma Aldrich 861987 Store at 2-8 °C
Cefsulodin sodium salt hydrate Sigma Aldrich C8145 Store at 2-8 °C
Rappaport-Vassiliadis (RV) medium Fisher Scientific CM0669B *Multiple suppliers.
Tetrathionate (TT) Broth Becton, Dickson and Company 249120 *Multiple suppliers.
Trypticase soy agar (TSA) Becton, Dickson and Company 236930 *Multiple suppliers.
Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar Becton, Dickson and Company 221284 *Multiple suppliers.
API Biochemical identification system bioMérieux Various *Call for information: +1.800.682.2666
VITEK 2: Product Safety bioMérieux Various *Call for information: +1.800.682.2667
BAX System Q7 DuPont N/A
BAX E. sakazakii Standard assay kit DuPont D11801836 *
BAX L. monocytogenes 24E assay kit DuPont D13608125 *
BAX Salmonella 2 Standard assay kit DuPont D14368501 *
Capping tool DuPont D11677028
Decapping tool DuPont D11134095
PCR tube rack/holder DuPont D12701663
Featherweight forceps, wide tip BioQuip 4750 Sterilize before use. Multiple suppliers.
Fine point, straight tip forceps BioQuip 4731 Sterilize before use. Multiple suppliers.
Zirconia/silica beads, 0.5 mm Bio Spec Products, Inc. 11079105z Multiple suppliers.
Petri dishes – 60X15mm Fisher Scientific 08-772B Multiple suppliers.
Disposable inoculating loops, 10µL Fisher Scientific 22-363-606 Multiple suppliers.
L-shaped cell spreaders Fisher Scientific 14-665-230 Multiple suppliers.
Microcentrifuge tubes, 2 ml Fisher Scientific Various Sterilize before use when needed. Secure lid is preferred. Multiple suppliers.
Cluster tubes Fisher Scientific 05-500-13
Cluster tubes caps Fisher Scientific 05-500-23
Sodium hypochlorite (Liquid chlorine bleach) N/A N/A *Dilute to 0.05% with water. Multiple suppliers.
Sterile deionized water N/A N/A Multiple suppliers.
Sterile distilled water N/A N/A Multiple suppliers.
Ethyl alcohol 190 proof N/A N/A *Dilute to 70% with water when needed. Multiple suppliers.
Genie cell disruptor, 120V – for 1.5ml and 2.0ml microtubes Scientific Industries, Inc. SI-D238 Multiple suppliers.
Heating block N/A N/A Multiple suppliers.
Cooling block N/A N/A Multiple suppliers.
Recirculating water bath N/A N/A Multiple suppliers.
Stereo microscope N/A N/A Multiple suppliers.
Centrifuge N/A N/A Multiple suppliers.
Incubator N/A N/A Multiple suppliers.
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Foodborne PathogensFilth FliesCronobacter Spp.Salmonella EntericaListeria MonocytogenesPCR-based DetectionEnvironmental SamplingFoodborne Outbreak InvestigationsInsect Vectors

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Pava-Ripoll, M., Pearson, R. E., Miller, A. K., Ziobro, G. C. Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies. J. Vis. Exp. (96), e52372, doi:10.3791/52372 (2015).
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