個々のフィルスのハエから食中毒細菌性病原体の検出

ハエの1コレクション無菌昆虫学スイープネットを使用して、個々のハエを収集します。クーラーにネットを入れて、ラボに転送。 ハエの2解剖 7分 – 5 -20℃でそれらを配置することにより、無菌的に収集したハエを固定。 予め温めた（37℃）の緩衝化ペプトン水（BPW）1 mlを含む無菌の2mlチューブに滅菌ピンセットを場所1のフライを使用する。 2分間の反転により穏やかにチューブを混ぜる。これは、ハエの体表面（S）上に存在する微生物叢はBPW（BPW-S）に転送されるように、ハエの全身が媒体と接触することが必須である。ハエの数と身体の部分（ すなわち、1S）でチューブにラベルを付けます。 注：このプロトコルに記載された材料および試薬の詳細な説明に特異的な試薬/機器の表を参照してください。 滅菌ピンセットを使用すると、BPW-Sメディアと転送からフライを削除空ときれいな2ミリリットルチューブにそれはハエの駆除表面に。消毒と解剖のプロトコルを実行しながら、37℃でBPW-Sメディアを含むチューブをインキュベートします。 新たに調製した0.05％（v / v）の漂白剤溶液1ml中に浸漬する前に、滅菌蒸留水ですすぎ、続いて1分間、70％エタノール、1ml中に浸漬してフライを表面消毒する。滅菌蒸留水で3回すすいでください。オートクレーブし2ミリリットルチューブに最後のすすぎの水を移す。 注：フライ、チューブの内側に残っていることを確認しながら、千μlのマイクロピペットを使用するか、チューブを反転させた液体を毎回捨てる。表面消毒プロセスの各段階での反転により穏やかに混合。 、消毒プロセスの有効性を評価するトリプチケースソイ寒天（TSA）プレートの最後のすすぎ水を100μlを転送し、無菌のL字型使い捨てスプレッダーを用いて拡散した。 24時間、37℃でプレートをインキュベート。イン後cubation、任意の細菌コロニーの存在を登録します。 NOTE：TSAプレート上の細菌コロニーの存在は、非効率的な表面殺菌プロセスを示す。この場合は、体表面および消化管間の交差汚染を排除することはできないため、食品媒介病原体の存在は、ハエの体表面に報告されるべきである。 ハエを表面が-消毒した後、過剰の水を除去した後、滅菌した60ミリメートルの使い捨てペトリ皿にするためにオートクレーブペーパータオルの一片に転送します。 解剖顕微鏡下でペトリ皿を置き、双翅目家族20,21のための二値キーを使用して、種レベルにフライを識別する。 穏やかに無菌的にハエから肛門および全消化管（A）を引くし、オートクレーブ先端の細い鉗子を使用すると、0.5ミリメートルのジルコニア/シリカに予め温めておいた（37℃）BPW 1 mlを含む別の無菌の2mlチューブに移すビーズ（BPW-A）。ラベル番目個々のフライとフライ（ すなわち、1A）の身体部分のために選択したのと同じ数の電子管。 細胞破壊を用いて10分 – 5徹底的にBPW-Aを含むチューブを混ぜる。プロトコールの残りを行いながら36±1℃でインキュベートする。 バウチャーおよび/または長期的試料を保存する、新しい2 mlチューブにハエの残りの部分を配置し、1追加する – 95％エタノール2 mlを。 3.プライマリおよびセカンダリ濃縮サンプル数とフライのボディ部によると、メディアを含むすべてのプライマリおよびセカンダリ濃縮管にラベルを付けます。 無菌フードの下では、次のメディアを含む2ミリリットルのチューブを無菌にするBPW-S（表面）の300μlのを転送する： サルモネラの場合は 、予め加温した（42℃）BPWの1ミリリットルを使用しています。 24時間 – 22 42.5℃の循環水浴中でインキュベートする。二次濃縮のために、400＆＃に濃縮されたBPW100μlのを転送181;予め滅菌クラスターチューブに入れ、予め温めた（37℃）ブレインハートインフュージョン（BHI）ブロスリットル。 3時間37℃でインキュベートする。 クロノバクター属の場合は 、ノボビオシンに予め温めた（37℃）BPWの1ミリリットル（;ウォレス、M.、私信は10mg / L）を使用します。あるいは、一次濃縮などのサプリメント（バンコマイシンおよびセフスロジン）でR＆F エンテロバクター·サカザキ濃縮培養液の1ミリリットルを使用しています。 26時間 – 22、37℃でインキュベートする。二次濃縮のために、以前に滅菌クラスターチューブに配置された予め温めた（37℃）BHIブロスの400μlにノボビオシンで強化しBPW100μlのを転送する。 3時間37℃でインキュベートする。 L.のためにリステリア 、選択的なサプリメントで新たに調製したRT 24 リステリア増菌培養液（24 LEB）の1ミリリットルを使用しています。 44±5時間、37℃でインキュベートする。二次濃縮はLの検出に必要とされないリステリア 。 </li> BPW-Aとしてラベルチューブを使用して、上記3.2.3 – を繰り返して、3.2.1を繰り返します。 ターゲット食中毒病原体の増幅および検出のためのPCRベースのシステムの4準備ステップ4-8は、コンピュータ·ワークステーションを商業PCRサイクラー/検出器システムを使用し、すぐに使用できるキットは、 サルモネラ菌 （ サルモネラ 2標準アッセイキット）をスクリーニングするために、 クロノバクター属種（E.サカザキ標準アッセイキット）、およびリステリア·モノサイトゲネス（L.は 24Eアッセイキットリステリア ）。標準的なアッセイは、PCR終点検出を使用しています。各キットには、二本鎖DNAに結合する際に蛍光シグナルを発する挿入色素を用いたPCR-準備錠が含まれています。信号が正または負のソフトウェアによって解釈される融解曲線を生成し、PCRシステムプログラムの検出フェーズ中に取得される。 のmanufactuで指定された試薬および機器を準備各ターゲット食品媒介病原体当たりRERのプロトコル。 NOTE： サルモネラとクロノバクター属を検出するためのプロトコルは、Lを検出するためのプロトコルのに対して一段階溶解法を必要とするリステリア （それぞれ、セクション5および6を参照）は、2段階の溶解法を必要とする。 標的病原体のために特定のプログラムを選択する自動化された加熱ブロックをオンにします。 （ -ステップ6.2を参照してくださいLに溶解の一部2 リステリア用）と加熱ブロックが手動であれば別の方法として、（。 サルモネラのため、 クロノバクター属種、およびL.モノサイトゲネス ）〜37℃または55±2℃までの温度を設定95±3℃。 少なくとも2時間8℃ – そうでなければ2でそれらを冷やし、冷却ブロックがO / Nを冷蔵されていることを確認してください。 PCRベースの検出システムのコンピュータソフトウェアを使用して、製造者の指示に従ってラックファイルを作成。 ラベルとクラスタを手配チューブは、ラックファイルに従って、ラック内の溶解試薬を含む。 PCRベースの検出システム機器を初期化する。 5. サルモネラとクロノバクター属を検出するための溶解を実行します溶解バッファーの1 12ミリリットルボトルにプロテアーゼ150μlのを追加することによって、溶解試薬を準備します。 以前にラベルクラスターチューブのそれぞれに溶解試薬200μlのを転送します。 注： – 最大2週間、8℃、溶解試薬を含むクラスタ·チューブは2で保存することができる。 長いピペットチップを使用して、溶解試薬200μlのを含むクラスターチューブを対応する（ステップ3.2.1と3.2.2を参照）、二次濃縮サンプルの20μlのを転送する。各サンプルのために新しいピペットチップを使用してください。 注：PCR陽性/陰性サンプルのさらなる確認分析のための冷蔵庫（ サルモネラ ）またはRT（ クロノバクター属 ）で一次および二次濃縮から管を保管してください。 </LI> 溶解試薬200μlのを含むクラスタチューブに無菌のBHI培地20μlのを追加することによって、ネガティブコントロールを準備します。 溶解試薬​​200μlのを含むクラスターチューブに任意の既知のサルモネラやクロノバクター属菌株の（BHIで栽培）O / N細菌培養物の20μlのを追加することによって、ポジティブコントロールを準備します。 キャップクラスターチューブと緊密にキャッピングツールを使用して固定します。 標的病原体のために特定のプログラムを選択した後、自動化された加熱ブロック中クラスターチューブのラックを配置します。代替的に、10分間、95±3℃でインキュベートし、20分間37±2℃、クラスターチューブをインキュベートする。 5分間 – （8℃2）最後に、ブロックを冷却するクラスターチューブを転送する。 注：ライセートを含むクラスターチューブは2週間まで-20℃で保存することができる。 6. L.を検出するための溶解を実行しますリステリア 一部のいずれかを実行としての溶解は、以下の通り： 完全に解凍した溶解剤1のボトルに滅菌脱イオン水の1.8ミリリットルを追加します。 注：ストアは2で剤1を溶解する – 使用する準備まで、8℃。開いて希釈した後、室温で店 – 最大6ヶ月間（20〜30℃）。 1の比率（各サンプルあたり剤2を溶解希釈した溶解剤40μlのは1と10μL）：4のエージェント1と2を溶解結合します。クラスターチューブへの転送組み合わせた溶解剤を50μl。 4時間以内に混合物を使用してください。 主な濃縮されたサンプルの500μl加え組み合わせた溶解剤の50μlのを含むクラスタチューブに（ステップ3.2.3を参照）。 組み合わせた溶解剤の50μlに無菌の24 LEB500μlのを追加することによって、ネガティブコントロールを準備します。 O / N Lの500μlのを追加してポジティブコントロールを準備しますリステリア文化が組み合わさ溶解剤の50μlに24 LEBで栽培。 クラスターチューブに蓋を、穏やかに混合し、場所30分間37±1℃の加熱ブロック中。 注：PCR陽性/陰性サンプルのさらなる確認の解析のために冷蔵庫に主要濃縮から管を保管してください。 次のように溶解のパート2を実行します。 ステップ5.1および5.2の指示に従って溶解試薬を準備します。 使用して長いピペットチップは、溶解試薬200μlのを含むクラスタ管に部品1の溶解物の20μlのを転送する。各サンプルのために新しいピペットチップを使用してください。 キャップクラスターチューブと緊密にキャッピングツールを使用して固定します。 L.ための特定のプログラムを選択する自動化された加熱ブロック中のクラスタチューブを入れるリステリア 。代替的に、10分間、95±3℃でインキュベートし、30分間55±2℃、クラスターチューブをインキュベートする。 5分間 – （8℃2）最後に、ブロックを冷却するクラスターチューブを転送する。 注：ライセートを含むクラスターチューブは2週間まで-20℃で保存することができる。 7.水和物PCR-レディ錠チルド（4℃）のPCR冷却ブロックを選択して、挿入の上にPCRチューブラックを配置。 ラックファイルに従って、ホルダー内のターゲット食品媒介病原体のために（各キットに付属）PCR-準備錠を含むPCRチューブに対応置きます。 脱キャップツールを使用して、慎重にPCR-チューブからキャップを取り外します。キャップを廃棄し、各チューブは、タブレットが含まれていることを確認。 特定のPCRチューブに溶解物の転送（ リステリア菌の場合）50（ サルモネラとクロノバクター属の場合）μlあるいは30μlの。新たな光のキャップを使用して、キャッピングツールを使用してPCRチューブにしっかりと固定します。 注：PCR-準備タブレットに溶解液を添加した後、サンプルは2で冷やしたままでなければならない – PCRベースの検出システムにロードされるまで、8℃。 PCRチューブは、ボリューム全体が底トンにあることを保証するために数秒間、2500×gで遠心分離することができる彼はチューブ。 楽器の引き出しを開くことによって、PCRサイクラー/検出システムの機器にPCRチューブをロードします。 引き出しにウェルにPCRチューブのラックを配置し、チューブが正しく装着されていることを確認。 引き出しを閉じて、製造業者のプロトコルに記載されているように、プログラムを開始する。 注：PCRベースの機器は、それぞれの食品媒介病原体のためのサイクリングパラメータを事前に設定している。 PCRサイクリングのステータスバーは、プログラムの増幅部分が実行されていることを示す青いバーが表示されていることを確認します。 注： – 完了に3.5時間、標準的なPCRアッセイのために、完全なプ​​ログラム（増幅および検出）の処理時間は、約3を取る。 8.結果処理が完了すると、画面はサンプルとレビュー結果を除去するためのPCRベースのシステム機器からの指示に従います。 ターゲット食品媒介病原体は、試料中に存在する場合（いずれか表面またはハエの消化管）ウェルは、プラス記号（正）と赤です。病原体が存在しない場合、ウェルは「マイナス」記号（負）と緑です。 井戸はセンター全体赤いバーのある黄色の場合、信号エラーを示します。 PCR陽性の結果から細菌性病原体の9の単離 （ リステリア菌の場合）プライマリまたはセカンダリからのPCR陽性であったこれらのサンプルの濃縮（ サルモネラとクロノバクター属の場合）を選択し、チューブ。 ：PCR-陰性であったサンプルの5％と、以下のように進む – また、ランダムに3を選択 サルモネラの場合： ラパポート·バシリアディス（RV）培地と（TT）ブロス四チオンの1ミリリットルの10ミリリットルに二次濃縮メディアの100μlのを追加します。 24時間 – 22のための再循環水浴中で42.5℃でチューブをインキュベートします。 インキュベーション後、各ストリーク3ミリメートルの白金耳（10μL）、RV ANビスマス亜硫酸塩（BS）寒天、キシロースリジンデソキシコール（XLD）寒天上のD TTメディア、およびHektoenの腸溶性（HE）寒天。 24時間 – 22 35±1℃でプレートをインキュベートする。 インキュベーション後、各メディア上の典型的なサルモネラコロニーの存在のためにプレートを調べます。孤立コロニーは、いくつかのサブ培養工程後に得られない場合は、PCRベースのシステムのための偽陽性を陰性と報告などの試料を検討する。 注：典型的なサルモネラのために特定のメディア上のコロニーが22を参照してください。 5推定典型的なサルモネラコロニーを選択して、孤立した/単一コロニーの純粋培養が得られるまで、BS、XLD、またはHEにそれらを継代培養。 1純粋なコロニーを選択し、製造者の指示に従って、そのようなVITEK 2識別カードまたはAPI生化学識別システムなどの生化学的、商業試験を使用して推定サルモネラを識別します 。 クロノバクター属の場合：<OL> ストリークようなR＆F エンテロバクター·サカザキ （ クロノバクター属 ）発色性メッキ媒体、および/ ​​またはChromID サカザキ寒天などの発色性培地の二つのプレート上の二次濃縮メディアの3ミリメートルの白金耳（10μL）。 24時間 – 22、35℃でプレートをインキュベートする。 インキュベーションの後、典型的なクロノバクター属のコロニー（ブルーブラックブルーグレーに）の存在のためにプレートを調べます。 5推定クロノバクター属のコロニーを選択して、孤立した/単一コロニーの純粋培養が得られるまで、R＆F エンテロバクター·サカザキ （ クロノバクター属 ）発色性メッキ媒体、ChromID サカザキ寒天、またはTSA上にそれらを継代培養。 注記：孤立したコロニーは、いくつかのサブ培養工程後に得られない場合は、PCRベースの検出システムのための偽陽性を陰性と報告などの試料を検討する。 1純粋なコロニーを選択し、生化学コマーを使用して推定クロノバクター属を識別製造者の指示に従ってそのようなVITEK 2識別カードまたはAPI 20E生化学識別システムとして金融試験。 L.のためにリステリア ： ストリークブリリアンスリステリア寒天の二つのプレート上の主要な濃縮メディアの3ミリメートルの白金耳（10μL）（BLA）。 26時間 – 22 36±1℃でプレートをインキュベートする。 インキュベーション後、推定L.の存在についてプレートを調べるリステリア （青緑色）コロニー。 5推定L.を選択リステリア コロニーと孤立/単一コロニーの純粋培養を得るまでBLAにそれらを継代培養。 26時間 – 追加の22のための36±1℃での負極板を再インキュベートする。 1純粋なコロニーを選択し、推定Lを識別するメーカーの私以下、そのようなVITEK 2識別カードまたはAPIリステリア生化学識別システムなどの商用生化学試験を使用することによりリステリアnstructions。 昆虫から分離推定食品媒介病原体は、前記基準検査室で確認され、血清型べきである。