光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

細胞および生物中のタンパク質のレベルは、製造及びクリアランス形成速度によって決定される。タンパク質半減期は数分から数日^1-4の範囲とすることができる。多くの生物学的システムでは、重要なタンパク質の安定化またはクリアランスは、細胞活性に重要な影響を有している。細胞内のタンパク質の安定性の調節は、細胞周期の進行^5,6、発達シグナリング^7-9、アポトーシス^10、および正常な機能およびニューロン^11,12の維持に必要である。細胞外タンパク質の安定性は、組織内のモルフォゲン^13,14、などの分泌タンパク質の分布と可用性に影響を与えます。

過去数十年にわたって、タンパク質の安定性は、主に放射パルス標識またはシクロヘキシミドチェイス実験^15を使用して、細胞培養において評価されている。このようなパルスチェイス実験において、細胞を一過放射性アミノ酸の「パルス」に露出されている新たに合成されたタンパク質に組み込まれているか、又はそれらは、タンパク質合成を阻害するシクロヘキシミド、にさらされている酸前駆体。培養された細胞は、その後の異なる時点で、そしていずれかの免疫沈降は、（放射パルスチェイス実験において）、続いてオートラジオグラフィーまたはウェスタンブロッティング（シクロヘキシミド実験で）収集され、経時的タンパク質のクリアランスを定量化するために使用される。

従来のタンパク質安定性アッセイは、いくつかの欠点を有する。まず、これらのアッセイにおけるタンパク質は、しばしば、それらの内因性の環境において発現されるのではなく、異なる種由来の細胞組織培養において、時には。その安定性はコンテキスト依存であるタンパク質については、このアプローチには問題がある。第二に、時間をかけて、個々の細胞または生物におけるタンパク質のクリアランスに追従することができず、これらのアッセイからのデータは、異なる時点で細胞の異なる集団の平均を反映している。個々の細胞が開始している可能性があるのでタンパク質の異なる量、異なる時間に放射性標識またはシクロヘキシミドを取り上げてもよいし、異なるクリアランス速度を有していてもよく、そのような集計データは誤解を招く可能性がある。最後に、シクロヘキシミドチェイス実験の場合、タンパク質合成阻害剤の添加は、人為的にタンパク質の安定性^16-18を変えることができ、意図しない生理学的効果を有することができる。これらの欠点は、光変換（FDAP）後に蛍光減衰を使用して（FDAP技術の限界のための説明を参照）、生物^19-25で動的にタンパク質クリアランスを測定するためにphotoconvertibleタンパク質を利用して技術を避けることができる。

Photoconvertibleタンパク質は、その励起および発光特性は、光²⁶の特定の波長に暴露された後に変更蛍光タンパク質である。 1つの一般的に使用される変形はDendra2、最初にEXを持つ「グリーン·ツー·赤」photoconvertibleタンパク質である緑色蛍光タンパク質と同様の引用及び発光特性が、UV光- 「光変換」 -そのへの曝露後に、励起/発光特性は、赤色蛍光タンパク質^23,27と同様になる。重要なことは、光変換後に生成新しいタンパク質はphotoconvertedタンパク質の唯一のプールの光変換時の生産とクリアランスのデカップリングと観察を可能にphotoconvertedタンパク質と同じ励起/発光特性を持っていません。 photoconvertibleタンパク質と目的のタンパク質にタグを付けるため、そのまま、光学的にアクセス可能な生物中のタンパク質ラベルのパルスに便利な方法を提供します。

FDAPアッセイ（ 図1A）において、目的タンパク質はphotoconvertibleタンパク質でタグ付けされ、生体（ 図1B）で表さ。融合タンパク質はphotoconvertedされ、経時photoconvertedシグナルの減少はfluorescenによって監視されているCE顕微鏡（ 図1C）。データは、その後、融合タンパク質（ 図1D）の半減期を決定するために適切なモデルが取り付けられている。

ここで説明FDAPアッセイは、初期胚発生¹⁹時のゼブラフィッシュ胚における分泌されたシグナル伝達タンパク質の細胞外半減期を決定するために設計されました。しかし、このアプローチは、ライブイメージングを許容し、かつ任意のタグ付け、細胞内または細胞外タンパク質のクリアランスを監視するために使用することができる任意の透明なモデル生物に適合させることができる。ここに記載の技術の変形は、培養細胞^20,23およびショウジョウバエ ²²及びマウス²¹胚で行われている。