Измерение белка стабильности в жизни у эмбрионов данио рерио с помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP)
Summary
Уровни белка в клетках и тканях часто жестко регулируется баланс производства белка и оформления. С помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP), зазор кинетика белков может быть измерена экспериментально в естественных условиях.
Abstract
Стабильность белка влияет на многие аспекты биологии и измерения зазора кинетики белков может обеспечить важную информацию в биологических системах. В FDAP экспериментов, очистка белков внутри живых организмов могут быть измерены. Интересующий белок помечен photoconvertible флуоресцентного белка, выраженного в естественных условиях и photoconverted и уменьшение photoconverted сигнала с течением времени контролируется. Затем данные снабжены соответствующей модели зазора определения белка полураспада. Важно отметить, что оформление кинетика населения белка в различных отсеках организма могут быть рассмотрены отдельно, применяя на отсеки маски. Этот подход был использован для определения внутри- и внеклеточного полураспада секретируемых белков сигнализации во данио развития. Здесь мы опишем протокол для FDAP экспериментов у эмбрионов данио рерио. Должна быть возможность использовать FDAP определить зазор кинетикилюбой taggable белка в любой оптически доступной организма.
Introduction
Уровни белков в клетках и организмах определяется их темпов производства и оформления. Белковые полураспада может составлять от нескольких минут до нескольких дней 1-4. Во многих биологических системах, стабилизация или оформление ключевых белков имеет важные последствия для клеточной активности. Модуляция внутриклеточного стабильности белка требуется для прогрессии клеточного цикла 5,6, Сигнализация развития 7-9 апоптоза 10, и нормальной функции и содержание нейронов 11,12. Внеклеточный стабильность белков влияет на распределение и наличие секретируемых белков, таких как морфогенов 13,14, внутри ткани.
За последние несколько десятилетий, стабильность белков в основном были оценены в культуре клеток с помощью радиоактивных пульс-мечение или циклогексимид эксперименты погони 15. В таких импульсов-чейз экспериментов клетки либо временно воздействию "импульс" радиоактивного аминопредшественники кислот, которые включены во вновь синтезированных белков, или они подвергаются циклогексимидом, который ингибирует синтез белка. Культивируемые клетки затем собирают в различные моменты времени, и либо иммунопреципитации с последующим авторадиографии (в экспериментах радиоактивных импульса-чейз) или Вестерн-блоттинга (в циклогексимид экспериментов) используется для количественной оценки зазор белка с течением времени.
Обычные анализы стабильности белка имеют ряд недостатков. Во-первых, белки в этих анализах часто не выраженные в их эндогенных среде, а в культуре ткани, а иногда и в клетках из различных видов. Для белков, стабильность зависит от контекста, этот подход является проблематичным. Во-вторых, это не возможно, чтобы следовать зазор белка в отдельных клеток или организмов с течением времени, и данные из этих тестов отражает среднее число различных популяций клеток в различные моменты времени. Так как отдельные клетки, возможно, началис различным количеством белка, возможно, взяли на себя радиоактивную метку или циклогексимид в разное время, или могут иметь различные оформления кинетики, такие совокупные данные могут вводить в заблуждение. Наконец, в случае циклогексимид экспериментов Chase, добавление ингибитора синтеза белка может иметь нежелательные физиологические эффекты, которые могут искусственно изменяют стабильность белка 16-18. Эти недостатки можно избежать с помощью флуоресценции упадок после фотопреобразования (FDAP), техника, которая использует photoconvertible белки для измерения зазора белка динамически в живых организмах 19-25 (см Обсуждение на ограничения метода FDAP).
Photoconvertible белки флуоресцентные белки, возбуждения и эмиссии свойства изменяются после воздействия определенных длин волн света 26. Одной из наиболее распространенных вариант Dendra2, "зеленый к красный" photoconvertible белок, который изначально имеет эксЦитирование и выбросов свойствами, аналогичными свойствам зеленого флуоресцентного белка, но после воздействия УФ-СВЕТА "фотопреобразования" -its возбуждение / эмиссионные свойства становятся аналогичными красных флуоресцентных белков 23,27. Важно отметить, что новый белок, вырабатываемый после фотопреобразования не будет иметь те же свойства возбуждения / испускания как photoconverted белка, что позволяет развязку производства и оформления на фотопреобразования и наблюдать только в бассейне photoconverted белка. Маркировка белки, представляющие интерес с photoconvertible белков, таким образом, обеспечивает удобный способ широтно-метки белков в неповрежденных, оптически доступных живых организмов.
В FDAP анализа (рис 1а) интерес белок помечен photoconvertible белка и выразил в живом организме (рис 1б). Слитый белок photoconverted, и уменьшение photoconverted сигнала с течением времени контролируется fluorescenCE микроскопии (рис 1С). Затем данные снабжены соответствующей модели, чтобы определить период полураспада слитого белка (фиг 1D).
FDAP анализа, описанного здесь был разработан, чтобы определить, внеклеточные полураспада, выделяемых сигнальных белков у эмбрионов данио рерио во время раннего эмбриогенеза 19. Тем не менее, этот подход может быть приспособлен к любому прозрачного модельного организма, что терпит живого изображения, и могут быть использованы для мониторинга зазора любой taggable внутриклеточного или внеклеточного белка. Вариации методике, описанной здесь, были выполнены в культивируемых клетках дрозофилы 20,23 и 22, и 21 мышей эмбрионы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успех эксперимента FDAP опирается на генерацию функциональной photoconvertible слитого белка. Пометка белок может повлиять на его биологическую активность и / или биофизические свойства, в том числе его локализации, растворимости, стабильности и 36-41. Будьте готовы проверить активность ра?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Джеффри Фаррелл, Джеймс Ганьон, и Дженнифер Бергманн замечания по рукописи. KWR при поддержке Национального научного фонда аспирантуру Научно-исследовательского стипендий в процессе разработки анализа FDAP. Эта работа была поддержана грантами от NIH к AFS и за счет субсидий из Немецкого исследовательского фонда (Эмми Нётер Program), Общество Макса Планка, и программа в области пограничной науки (премии развития карьеры) до вечера.
Materials
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) | To generate capped mRNA for injection into embryos | ||
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks | ||
| 6-well plastic dish (BD Falcon) | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | ||
| Embryo medium | 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage | ||
| 5 cm diameter glass petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use | ||
| Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos | ||
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 | ||
| 15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | ||
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25x or 40x water objective | Objective for imaging | ||
| 10x air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
- Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O’Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Parry, D. H., O’Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
- Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
- Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
- MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
- Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
- Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -. Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
- Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
- Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
- Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
- Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
- Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
- Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
- Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
- Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
- Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
- Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
- Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
- Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
- Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
- Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
- Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
- Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
- Bläßle, A., Müller, P. . PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, (2014).
