Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo's met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)
Summary
Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.
Abstract
Eiwitstabiliteit invloed op vele aspecten van de biologie, en het meten van de klaringskinetiek van eiwitten kan belangrijke inzichten verschaffen in biologische systemen. In FDAP experimenten, kan de klaring van eiwitten in levende organismen worden gemeten. Een eiwit van belang wordt gelabeld met een photoconvertible fluorescent eiwit expressie in vivo en photoconverted, en de daling van de photoconverted signaal over de tijd wordt gecontroleerd. De gegevens worden vervolgens voorzien van een geschikt klaringsmodel de halfwaardetijd van het eiwit te bepalen. Belangrijk is dat de klaringskinetiek eiwit populaties in verschillende compartimenten van het organisme worden afzonderlijk door toepassing compartimentele maskers onderzocht. Deze benadering is gebruikt om de intra- en extracellulaire halfwaardetijden van uitgescheiden signaaleiwitten bepaalt gedurende ontwikkeling van de zebravis. We beschrijven hier een protocol voor FDAP experimenten in de zebravis embryo's. Het moet mogelijk zijn om FDAP om de kinetiek van de klaring bepalenelke taggable eiwit in elk optisch toegankelijke organisme.
Introduction
De niveaus van proteïnen in cellen en organismen worden bepaald door de productiesnelheden en klaring. Eiwit halfwaardetijden kan variëren van enkele minuten tot dagen 1-4. In veel biologische systemen, de stabilisatie of klaring van belangrijke eiwitten heeft belangrijke gevolgen voor de cellulaire activiteit. Modulatie van intracellulair eiwit stabiliteit vereist voor celcyclusprogressie 5,6, ontwikkelings signalering 7-9, apoptose 10 en normale functie en onderhoud van neuronen 11,12. Extracellulaire proteïne stabiliteit beïnvloedt de verdeling en de beschikbaarheid van uitgescheiden eiwitten zoals morfogenen 13,14 binnen een weefsel.
In de afgelopen decennia heeft eiwitstabiliteit vooral beoordeeld in celkweek met behulp van radioactieve pulse-labeling of cycloheximide chase experimenten 15. In dergelijke pulse-chase experimenten worden cellen hetzij tijdelijk blootgesteld aan een "puls" van radioactieve aminozuurvoorlopers die zijn opgenomen in nieuw gesynthetiseerde eiwitten of ze worden blootgesteld aan cycloheximide, die eiwitsynthese remt. Gekweekte cellen worden dan verzameld op verschillende tijdstippen, en hetzij immunoprecipitatie gevolgd door autoradiografie (radioactieve pulse-chase experimenten) of western blotting (in cycloheximide experimenten) wordt gebruikt om de klaring van eiwit kwantificeren tijd.
Conventionele eiwitstabiliteit assays meerdere tekortkomingen. Eerst eiwitten in deze assays worden vaak niet uitgedrukt in hun endogene omgevingen, maar in weefselkweek en soms van verschillende species. Voor eiwitten waarvan de stabiliteit is contextafhankelijk deze benadering problematisch. Ten tweede is het niet mogelijk om eiwitten speling in individuele cellen of organismen te volgen in de tijd en de gegevens van deze testen geeft een gemiddelde van verschillende populaties van cellen op verschillende tijdstippen. Aangezien individuele cellen kan zijn begonnenmet verschillende hoeveelheden eiwit, mogen hebben de radioactieve merker of cycloheximide op verschillende tijdstippen, of kunnen verschillend klaringskinetiek, zoals geaggregeerde gegevens misleidend kunnen zijn. Tenslotte, bij cycloheximide chase experimenten toevoeging van de eiwitsyntheseremmer kan onbedoelde fysiologische effecten die kunstmatig eiwit stabiliteit 16-18 kunnen veranderen hebben. Deze gebreken kunnen worden vermeden door gebruik fluorescentievervaltijd Na Photoconversion (FDAP), een techniek die gebruik maakt photoconvertible eiwitten proteïne klaring dynamisch meten levende organismen 19-25 (zie bespreking beperkingen van de FDAP techniek).
Photoconvertible eiwitten zijn fluorescerende eiwitten waarvan excitatie en emissie-eigenschappen veranderen na blootstelling aan specifieke golflengten van het licht 26. Een vaak gebruikte variant is Dendra2, een "groen-to-rode" photoconvertible eiwit dat in eerste instantie heeft excitatie en emissie eigenschappen vergelijkbaar groen fluorescerende eiwitten, maar na blootstelling aan UV licht- "fotoconversie" -haar excitatie- / emissie-eigenschappen worden vergelijkbaar met die van rode fluorescente proteïnen 23,27. Belangrijk is dat nieuwe eiwit geproduceerd na photoconversion niet hetzelfde excitatie / emissie-eigenschappen als de photoconverted eiwit, waardoor ontkoppeling van de productie en de klaring na photoconversion en observatie van slechts een pool van photoconverted eiwit. Tagging eiwitten van belang met photoconvertible eiwitten biedt dus een handige manier om de pulse-label eiwitten in intacte, optisch toegankelijke levende organismen.
In FDAP assays (figuur 1A), is een eiwit van belang gelabeld met een photoconvertible eiwit en uitgedrukt in een levend organisme (Figuur 1B). Het fusie-eiwit wordt photoconverted en de daling photoconverted signaal over de tijd wordt gecontroleerd door fluorescence microscopie (figuur 1C). De gegevens worden vervolgens voorzien van een geschikt model om de halfwaardetijd van het fusie-eiwit (figuur 1D) te bepalen.
De FDAP assay beschreven is ontworpen om het extracellulaire halfwaardetijden van uitgescheiden signaaleiwitten in zebravisembryo bepalen tijdens de vroege embryogenese 19. Echter, kan deze benadering worden aangepast aan elke transparante modelorganisme dat live beeldvorming tolereert, en kunnen worden gebruikt om de klaring van taggable intracellulair of extracellulair eiwit controleren. Variaties van de hier beschreven techniek zijn uitgevoerd in gekweekte cellen 20,23 en Drosophila 22 en muis 21 embryo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het succes van een FDAP proef berust op het genereren van een functioneel photoconvertible fusieproteïne. Tagging een eiwit kan zijn biologische activiteit en / of biofysische eigenschappen, zoals de lokalisatie, oplosbaarheid en stabiliteit 36-41 beïnvloeden. Wees bereid om de activiteit van verschillende fusieconstructen testen om een die actief is te vinden. Wij hebben gevonden dat de positie van de photoconvertible eiwit ten opzichte van het eiwit van interesse of met meer linkers (bijvoorbeel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Jeffrey Farrell, James Gagnon, en Jennifer Bergmann bedanken voor commentaar op het manuscript. KWR werd gesteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program tijdens de ontwikkeling van de FDAP test. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH aan AFS en door subsidies van de Duitse Stichting voor Onderzoek (Emmy Noether Program), het Max Planck Instituut en het Human Frontier Science Program (Career Development Award) naar PM.
Materials
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) | To generate capped mRNA for injection into embryos | ||
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks | ||
| 6-well plastic dish (BD Falcon) | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | ||
| Embryo medium | 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage | ||
| 5 cm diameter glass petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use | ||
| Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos | ||
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 | ||
| 15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | ||
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25x or 40x water objective | Objective for imaging | ||
| 10x air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
- Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O’Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Parry, D. H., O’Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
- Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
- Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
- MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
- Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
- Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -. Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
- Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
- Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
- Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
- Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
- Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
- Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
- Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
- Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
- Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
- Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
- Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
- Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
- Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
- Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
- Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
- Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
- Bläßle, A., Müller, P. . PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, (2014).
