قياس الاستقرار البروتين المتواجد في الحي اسماك الزرد الأجنة عن طريق الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)
Summary
وغالبا ما ينظم مستويات البروتين في الخلايا والأنسجة بإحكام بواسطة ميزان إنتاج البروتين والتخليص. باستخدام الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)، حركية إزالة البروتينات يمكن قياسها تجريبيا في الجسم الحي.
Abstract
استقرار البروتين يؤثر جوانب كثيرة من الأحياء، ويمكن قياس حركية إزالة البروتينات توفر معلومات هامة في النظم البيولوجية. في التجارب FDAP، يمكن قياس إزالة البروتينات داخل الكائنات الحية. والموسومة بروتين في المصالح مع بروتين فلوري photoconvertible، أعرب في الجسم الحي وphotoconverted، ويتم رصد انخفاض في إشارة photoconverted مع مرور الوقت. ثم تم تجهيز البيانات مع نموذج التخليص المناسب لتحديد بروتين نصف الحياة. الأهم من ذلك، يمكن فحص حركية تخليص السكان من البروتين في مقصورات مختلفة من الكائنات الحية بشكل منفصل من خلال تطبيق أقنعة المجزئ. وقد استخدم هذا الأسلوب لتحديد نصف العمر البينية وخارج الخلية من البروتينات مما يشير يفرز خلال تطوير الزرد. هنا، نحن تصف بروتوكول للتجارب FDAP في الأجنة الزرد. ينبغي أن يكون من الممكن استخدام FDAP لتحديد حركية تطهيرأي بروتين taggable في أي كائن الوصول بصريا.
Introduction
ويتم تحديد مستويات البروتينات في الخلايا والكائنات الحية بنسب إنتاجها والتخليص. يمكن أن البروتين نصف العمر تتراوح بين دقائق إلى أيام 1-4. في كثير من النظم البيولوجية، والاستقرار أو التخليص من البروتينات الرئيسية له آثار مهمة على النشاط الخلوي. مطلوب تعديل للاستقرار البروتين داخل الخلايا لتقدم دورة الخلية 5،6، مما يشير التنموية 7-9، موت الخلايا المبرمج 10، وظيفة عادية وصيانة الخلايا العصبية 11،12. يؤثر الاستقرار البروتين خارج الخلية توزيع وتوافر البروتينات يفرز مثل morphogens 13،14، داخل الأنسجة.
على مدى العقود القليلة الماضية، أساسا تم تقييم استقرار البروتين في زراعة الخلايا باستخدام المشع نبض وضع العلامات أو التجارب مطاردة سيكلوهيكسيميد 15. في مثل هذه التجارب نبض مطاردة، وإما عابر تتعرض الخلايا إلى "نبض" للالأمينية المشعالسلائف حمض التي يتم إدراجها في البروتينات تصنيعه حديثا، أو يتعرضون لسيكلوهيكسيميد، الذي يثبط تخليق البروتين. ثم يتم جمع الخلايا المستزرعة في نقاط زمنية مختلفة، ويستخدم إما مناعي تليها تصوير الإشعاع الذاتي (في المشعة التجارب نبض مطاردة) أو ويسترن النشاف (في التجارب سيكلوهيكسيميد) لقياس التخليص من البروتين مع مرور الوقت.
التقليدية المقايسات الاستقرار البروتين لديهم العديد من أوجه القصور. أولا، وغالبا ما تكون غير أعرب البروتينات في هذه المقايسات في بيئاتهم المحلية، وإنما في زراعة الأنسجة وأحيانا في الخلايا من الأنواع المختلفة. للبروتينات التي الاستقرار هو تعتمد على السياق، وهذا النهج هو إشكالية. ثانيا، ليس من الممكن لمتابعة إزالة البروتين في الخلايا الفردية أو الكائنات الحية على مر الزمن، والبيانات من هذه المقايسات يعكس ما معدله مجموعات مختلفة من الخلايا في نقاط زمنية مختلفة. منذ الخلايا الفردية قد بدأتمع كميات مختلفة من البروتين، قد اتخذوا التسمية المشعة أو سيكلوهيكسيميد في أوقات مختلفة، أو قد يكون حركية التخليص مختلفة، مثل هذه البيانات الإجمالية يمكن أن تكون مضللة. وأخيرا، في حالة من التجارب مطاردة سيكلوهيكسيميد، إضافة تخليق البروتين المانع قد يكون لها آثار فسيولوجية غير مقصودة يمكن أن يغير بشكل مصطنع الاستقرار بروتين 16-18. ويمكن تجنب هذه العيوب باستخدام الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)، وهي تقنية تستخدم البروتينات photoconvertible لقياس إزالة بروتين حيوي في الكائنات الحية 19-25 (انظر مناقشة لقيود تقنية FDAP).
البروتينات Photoconvertible هي البروتينات الفلورية التي الإثارة وخصائص الانبعاثات تغيير بعد التعرض للموجات محددة من الضوء 26. واحدة البديل شيوعا هو Dendra2، وهو بروتين photoconvertible "الأخضر إلى الأحمر" الذي لديه في البداية السابقالاقتباس والانبعاثات خصائص مشابهة لالبروتينات الفلورية الخضراء، ولكن بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ضوئية "photoconversion" -its الإثارة / خصائص الانبعاثات تصبح مماثلة لتلك التي من البروتينات الفلورية الحمراء 23،27. الأهم من ذلك، سوف تنتج البروتين الجديد بعد photoconversion ليس لديه نفس الخصائص الإثارة / الانبعاثات مثل البروتين photoconverted، مما يسمح للفصل الإنتاج والتخليص على photoconversion ومراقبة سوى مجموعة من البروتين photoconverted. علامات البروتينات في المصالح مع البروتينات photoconvertible بالتالي يوفر وسيلة مريحة لنبض التسمية البروتينات في الكائنات الحية سليمة، ويمكن الوصول إليها بصريا.
في المقايسات FDAP (الشكل 1A)، والموسومة بروتين في المصالح مع بروتين photoconvertible وأعرب في كائن حي (الشكل 1B). وphotoconverted البروتين الانصهار، ويتم رصد انخفاض في إشارة photoconverted مع مرور الوقت من قبل fluorescenم المجهري (الشكل 1C). ثم تم تجهيز البيانات مع نموذج مناسب لتحديد عمر النصف من البروتين الانصهار (الشكل 1D).
وقد تم تصميم مقايسة FDAP الموضحة هنا لتحديد الخلية أعمار النصف من يفرز البروتينات مما يشير في الأجنة الزرد خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر 19. ومع ذلك، يمكن تكييف هذا النهج إلى أي كائن نموذج شفاف تتسامح التصوير الحي، ويمكن استخدامها لمراقبة إزالة أي البروتين داخل الخلايا أو الخلية taggable. وقد أجريت الاختلافات في تقنية الموضحة هنا في الخلايا المستزرعة 20،23 وذبابة الفاكهة 22 و الماوس 21 الأجنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نجاح تجربة FDAP يعتمد على توليد وظيفية photoconvertible البروتين الانصهار. يمكن وضع علامات البروتين يؤثر على نشاطها البيولوجي و / أو الخصائص الفيزيائية الحيوية، بما في ذلك تمركز لها، والذوبان، والاستقرار 36-41. تكون على استعداد لاختبار النشاط من عدة ثوابت الانصهار مختلفة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر جيفري فاريل، جيمس غانيون، وجنيفر بيرجمان للتعليق على المخطوطة. وأيد KWR من قبل البرنامج الوطني مؤسسة عليا العلوم بحوث زمالة خلال تطوير فحص FDAP. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة لAFS ومن المنح المقدمة من المؤسسة الألمانية للبحوث (برنامج نويثر إيمي)، وجمعية ماكس بلانك، وبرنامج الإنسان الحدودي العلوم (جائزة التطوير الوظيفي) لPM.
Materials
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) | To generate capped mRNA for injection into embryos | ||
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks | ||
| 6-well plastic dish (BD Falcon) | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | ||
| Embryo medium | 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage | ||
| 5 cm diameter glass petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use | ||
| Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos | ||
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 | ||
| 15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | ||
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25x or 40x water objective | Objective for imaging | ||
| 10x air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
- Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O’Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Parry, D. H., O’Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
- Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
- Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
- MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
- Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
- Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -. Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
- Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
- Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
- Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
- Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
- Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
- Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
- Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
- Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
- Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
- Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
- Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
- Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
- Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
- Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
- Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
- Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
- Bläßle, A., Müller, P. . PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, (2014).
