A Novel <em>In vitro</em> Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Sofia Nordling; Bo Nilsson; Peetra U. Magnusson

doi:10.3791/52112

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunology and Infection

A Novel<em> In vitro</em> İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

Published: November 21, 2014

doi:

10.3791/52112

Sofia Nordling¹, Bo Nilsson¹, Peetra U. Magnusson¹

¹Department of Immunology, Genetics and Pathology,Uppsala University

Summary

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Abstract

Tüm bilinen hastalıkların çoğunluğu kalp-damar sistemi bozukluklarının eşlik eder. Kalp-damar hastalıklarının sırasında aktif etkileşim yollarının karmaşıklığı çalışmalar, sağlam ve fizyolojik olarak ilgili yöntemler eksikliği ile sınırlıdır. Patolojik vasküler olayları modellemek için biz endotel ve bütün kan arasındaki etkileşimi incelemek için in vitro bir analiz geliştirdik. Tahlil, insan tüm kan ile temas halinde yerleştirilir primer insan endotel hücreleri oluşur. Yöntem, bir kan damarı içinde mevcut moleküler ve hücresel bileşenleri arasındaki hassas etkileşimlerin çalışma sağlayan, hiç veya çok az pıhtılaşma önleyici ile natif kan kullanmaktadır.

Biz ile ya da insan göbek bağı damarı endotel hücrelerinin (HUVEC) olmadan inkübe farklı kan hacmine göre pıhtılaşma aktivasyonu karşılaştırarak tahlilin özelliğe incelenmiştir. Daha büyük bir kan hacmi katkıda Oysatrombin antitrombin oluşumunda bir artış (TAT) kompleksleri, HUVEC varlığı koagülasyon indirgenmiş aktivasyonunu göstermiştir. HUVEC tümör nekroz faktörü (TNFa) ile uyarıldı ve kan temas sonrası, uyarılmamış hücrelere kıyasla, TNFa uyarılmış hücrelerde anlamlı olarak yüksek olduğu CD16 ⁺ hücrelerinin varlığı kurmak için Bundan başka, lökosit eklenme görüntü analizi uygulandı. Sonuç olarak, bu analiz, endotel ve kan bölmesi arasında etkileşimler altüst vasküler patolojiler, çalışma için tatbik edilebilir.

Introduction

Kardiyovasküler hastalık kan-damar etkileşimlerini analiz yöntemleri genel hayvan araştırma deneyleri içeren. Deneysel araştırmalar hayvan modellerinde oluşturulur Bununla birlikte, sonuçlar. Insan hastalıkları için çok az veya hiç bir etkisi vardır, ^1,2 olabilir, kan bölmesi ve vasküler endotel hücrelerinde arasındaki hücresel etkileşimlerini incelemek üzere in vitro modellerde iyi ve güvenli bir ihtiyaç vardır Bir insan gibi sistem. Bu nedenle bir kan endotel hücre odası modelini kurduk. Bu biyomalzeme ve insan bütün kan arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılan daha önce tarif edilen modeline dayanır., Genellikle saflaştırılmış bileşenler, sınırlı sayıda diğer in vitro kurulumları ³ aksine örneğin, trombositler, lökositler ya da endotel hücrelerinde mevcuttur, bu model, tüm kapsar Bileşenler, bir kan damarı içinde mevcut.

Kan endotel c kurulumuell odası modeli çok az veya hiç katma antikoagülan ile taze çekilmiş insan kanının kullanımını sağlamak için tasarlanmıştır. Uzun süreler boyunca depolanan kan yüzden eritrositlerin parçalanması kan ve endotel hücreleri arasındaki hassas etkileşim engel olabilir depolama lezyonlar olarak adlandırılan edinirler. ⁴

Ex vivo olarak bütün kanın kullanımı sırasında, pıhtı oluşumunu önlemek için antikoagülan veya kan ile temas halinde olan tüm madde olmayan aktive olması yüksek dozlar istenmektedir. Olmayan yüzey aktivasyonu laboratuar ortamında nadir olduğu için, malzeme seçenek olarak hareketsiz heparin bir koruyucu tabaka ile donatılmış olabilir. Hareketsizleştirilmiş heparin Koruyucu bir kat, kan iletişim Pıhtılaşma şelalesinin aktivasyonu neden olmaksızın ortaya çıkan bir yüzey oluşturarak çok malzeme tatbik edilebilir (buradan sonra Corline heparin yüzey (CHS) olarak anılacaktır). ⁵ Bu durumda, olan kabinleri mobilya tarafından CHS, kan endotel ceII haznesi modeli kan antikoagulan çok düşük konsantrasyonlarda kullanılmasını sağlar. Kan endotel odası modelinde antikoagülan yüksek konsantrasyonlarda ilave kaçınmak aksi maskelenebilir olabilecek bir kan damarının içindeki hassas etkileşimler üzerinde çalışmak mümkün kılar. ⁶

Plastik mikroskop lamı:;: (9 mm yarıçapı 8 mm yüksekliği) kan endotel hücre odası modeli plastik silindirler bağlanmasıyla oluşturulan iki odadan oluşmaktadır. Silindirlerin üzerinde yukarı bakacak şekilde kenarları hücre kültürü lâm odacıkları kapatılması için kullanılan lastik O-halkası ile donatılmıştır oluklar ile donatılmıştır. Bölmeler, yalnızca kısmen bölmeler daha sonra dik bir konumda (Şekil 1) döndürüldüğü zaman bölme içinde kalan bir hava hareketinin içine kan tutar olarak kan ile doldurulur.

Modelin işlevselliğini değerlendirebilmek için, biz ya da tamamen CHS, kaplanmış olan deneyler yaptıkodası veya İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC). İki ayrı kan hacmi deneye tabi tutuldu ve trombin antitrombin (TAT) komplekslerinin (pıhtılaşmasının dolaylı bir göstergesi) oluşumu enzim bağlantılı immunosorbent tahlil (ELISA) ile ölçüldü. Daha sonra kan miktarı ve tümör nekroz faktörü (TNFa), resim analizi ile lökosit göçünün endotel hücrelerini stimüle etkisini değerlendirmiştir.

Kan endotel hücre odası modeli 1. Setup Şekil. (A), en iyi PMMA yapılan kan odasının şematik bir çizimi görüntülemek. (B): Primer insan endotel hücreleri, 1-çukurlu oda slaytlar üzerinde kültürlenmiştir. Taze, insan bütün kan, bir mikroskop lamı üzerine iki bölme eklenir. Kan işlemek için kullanılan odaları ve tüm malzeme koruyucu HS kaplama ile tedavi edilir. Ce duvarlarını çıkardıktan sonrall kültür slayt, hücreler kana karşı karşıya yerleştirilir ve sistemin kapalı kenetlenir. (C) Kan endotel hücre bölmeler daha sonra 37 ° C olarak dönme altında inkübe edilir. Daha sonra, kan bölmesine reaksiyonlar ELISA ile analiz edilebilir ve endotel hücreleri mikroskopi ile analiz edilebilir.

Protocol

NOT: Kan Uppsala Etik Değerlendirme Kurulu (Izin sayılı 2008/264) ile onayı açık sistem Venipunktür sağlıklı bireylerden çizildi. 1. Tohum Hücreler T75 şişeleri içinde% 5 37 ° C'de CO2 ile kültür primer insan göbek damar endotelial hücreleri (HUVEC), PBS pH 7.4 içinde% 1 jelatin ile kaplanan. T75 HUVEC ihtiva eden bir şişeye (ya da primer insan endotelyal hücreleri bir türden) kültür ortamı çıkarın ve PBS pH 7.4 içinde 2.1 mM EDTA ile hücrelerin yıkayın. 37 ° C, 3 dakika – 1 mi,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyerek ve 2 inkübe edilerek hücreleri ayırın. PBS pH 7.4 içinde 9 ml% 10 FBS ile balon durulanarak hücrelerini toplamak ve 15 ml'lik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın. 5 dakika boyunca 735 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. Süpernatantı ve endotel hücre büyüme ortamı mikrovasküler (AT GMMV) dikkatli bir hücre pelletini tekrar süspansiyon ve bir Bürker bölmesi içinde hücreleri sayın. 21,000 c Seedarşın / 1-kuyulu hücre kültürü slaytlar cm2 ve 37 ° C'de inkübe edin. Kültür – 2 gün HUVEC sonra 1 birleştirilebilmeli olacaktır. Bir ışık mikroskobu altında hücre morfolojisi ve kaynaşma gazetesine izleyin. Tüm Kan 2. Hazırlık Üreticinin talimatlarına uygun olarak hareketsizleştirilen heparin (CHS) içindeki bir çift tabaka ile kan ile temas halinde olan tüm yapay yüzeylerin hazırlayın. Tozdan, CHS Kaplanmış malzemeler fonksiyon kaybı olmaksızın 6 aya kadar oda sıcaklığında saklanabilir. Kan endotel odası deneye başlamadan önce kısa bir süre sağlıklı bir donörden (<30 dakika) kan çekmek için açık sistem Damara kullanın. Dikkatli bir CHS kaplı 50 ml tüp kan toplama önce: (2 mm iç çap) çift bir derialtı iğne CHS kaplamalı silikon tüp için (18 G 50 mm x). Fraksiyonlanmamış heparin ile Ek kan 0.75 IU / ml'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere. Inve yavaşça kan karıştırın- 3 kez tüpü 2 rting. 3. Kan Endotel Odası Modeli PMMA slayt (25 x 75 mm) 'ye yapıştırılmıştır iki silindir (yükseklik 8 mm çapı 9 mm)' den oluşan akrilik polimetil metakrilat (PMMA) 'de, kan bölmeyi (üstten bakış Şekil 1A) imal. Kültürlü endotel hücreleri (Şekil 1B) ile cam slaytlar karşı kan odası mühür kauçuk O-halkaları ile yukarı bakacak silindir kenarlarına uyacak. Daha sonra dikey bir pozisyonda (Şekil 1C), endotel hücreleri ile kültür sürgüye bağlı olan, kan odaları döndürün. Kan etkinleştirmek için değil kamara alarak dikkat kaplı her CHS içine 1.5 ml kan aktarmak için bir CHS kaplı pipet kullanın. MK ul 0,34 3 EDTA 30 ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüplerine transfer 1 ml kan kullanılarak yapılan ilk plazma protein konsantrasyonlarının belirlenmesi için, 10 mM K 3 EDTA bir son konsantrasyon elde etmek üzerebir enzim immün testi (ELISA). Dikkatle kan karıştırın ve buz üzerinde tüpler tutmak. PBS pH 7.4 içinde Hücreleri yıkamak dikkatli bir şekilde, üretici talimatlarına uygun olarak hücre kültürü cam slaytların plastik duvarlar çıkarın ve. Sonradan slaytlar mümkün olduğunca çok sıvı çıkarmak için emin olun. Hücreler kurumasına izin vermeyin. Kan bakan hücreleri ile kan bölmelerin üzerine slayt yerleştirin. Kan endotel hücre odasının etrafında bir kelepçe koyarak slayt sabitleyin. Kelepçenin yerleştirirken hücre kültürü cam slayt kırılmasını önlemek için ek destek için plastik bir slayt kullanın. Bir 37 ° C su banyosu içinde dönen bir tekerlek üzerinde, kan endotel hücre bölme saptamak (40 cm çapında), bir yer. 30 dakika boyunca 0.5 xg'de tekerleğin her odasına döndürün. İnkübasyondan sonra, kan endotel hücre bölme ortadan kaldırmak. F PBS pH 7.4 'da hücre kültürü slaytlar yıkayıp (PFA), buz gibi soğuk% 1 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit edilmeleriya da 10 dakika. | Il 0.34 MK 3 EDTA 30 ihtiva mikrosantrifüj tüplerine her bölmeden transfer 1 ml kan, 10 mM K 3 EDTA bir nihai konsantrasyona ulaşmak ve Tüpleri yavaşça karıştırın. Buz üzerinde tüpler tutun. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 4560 x g'de tüpler santrifüjleyin. Daha fazla analiz edilinceye kadar -70 ° C'de yeni bir mikrosantrifüj tüpleri ve saklamak için kan plazması aktarın. Kan Endotel Etkileşimleri 4. Analizi İkinci keçi anti-fare Alexa 488 ve falloidin-TexasRed ardından fare anti-insan CD16 ile immünofloresan boyama yapın. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, her boyama adımı gerçekleştirmek ve her adım arasında PBS pH 7.4 slaytlar yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DAPI ile çekirdek Counterstain. Görüntü analizi gibi CellProfiler gibi uygun resim analiz yazılımı kullanılarak kombinasyon halinde floresan mikroskobu altında endotel hücrelerine bağlı kan bileşiklerinin analiz edin. QuantiFY plazma numunelerinin üreticinin talimatlarına göre trombin antitrombin (TAT) ELISA ile, kan bölmesine reaksiyonları. Uygun istatistiksel araçlar, örneğin kullanın., Eşleşmemiş bir t testi, verileri analiz etmek.

Representative Results

CHS Kaplama Gerekliliği Endotel hücreleri tarafından ortaya kişilerce belirli tam kanda tepkisini ölçmek için, kan endotel hücre bölmesi için kullanılan bütün malzeme kullanım öncesi CHS, bir kaplama ile temin edilmelidir. Şekil 2A, (sol) ve 30 dakika sonra, kaplanmamış odasını göstermektedir açıkça görülebilen bir pıhtı varken kan teması. Öte yandan, CHS ile bölmesi (Şekil 2A, sağ) tedavi edilmesi sonuçları, endotel hücre kan etkileşimler nedeniyle sağlanması, kontrolsüz aktivasyonu kan korur. Odasına Kan Hacminin Etkisi Aktive edilmiş koagülasyon faktörleri arasındaki etkileşim olasılığı artar gibi pıhtılaşma aktivasyonu durgun kan daha büyük ihtimal olması. Kan endotel hücre bölmesi modelinde kan bağlı bölmesi içinde hava kabarcığı dolaşımına hareket tutulur. O daSarf nedenle de hava kabarcığı boyutunu kan hacmindeki değişikliklerin etkisini belirlemek, ve, bir CHS kaplı odası, 1.5 ml veya 30 dakika boyunca 1.75 ml tam kan ile test edildi bir CHS kaplı cam slayt bağlandı. Kan 1.75 ml kan 1.5 mi (Şekil 2B) kullanılması durumuna kıyasla bölmeye eklendiğinde bir hava kabarcığı herhangi bir hareketi olmaksızın kan hacmi 2.5 kat daha büyüktür. Ölçülen TAT değerleri artmış kan hacmi (Şekil 2D) ile TAT-oluşumunu arttırmıştır önerdi. HUVEC (Şekil 2C), bütün haldeki kan, 1.5 veya 1.75 ya ml ile inkübe edildiğinde, herhangi bir fark endotel hücreleri, pıhtılaşmanın aktivasyon (Şekil 2D) etkili olabileceğini düşündürmektedir, iki grup arasında not edilmiştir. Kan Hücresi Elemanların TNFa'nin Etkisi ve pıhtılaşma aktivasyonu Lökosit istihdamına TNFa etkisini incelemek amacıyla, HUVEC tedavi edildi20 ng ed / ml TNFa 4 saat kan teması önce. Kan temas – ya 1.5 ml ya da 1.75 ml kan -, kültür slaytlar, CD16 (Şekil 2F) için boyandı ve bundan sonra, 30 dakika boyunca sürdürüldü görüntülenmiş ve CD16 + hücrelerinin sayısı hesaplandı edildi. CD16 + hücrelerin işe 1.5 ml kan ile 100 256 CD16 + hücre / mm 2 (p <0.0001) ve TNFa tedavisi (Şekil 2E) ile önemli ölçüde artmıştır ve 172 1.75 ml kan ile 378 (P <0.0001). TAT komplekslerin oluşumu ya da TNFa, işlenmiş ve işlenmemiş hücreleri (Şekil 2G) ile inkübe kan ilgili plazma örneklerinde ölçülmüştür. Muamele edilmemiş hücreler ile karşılaştırıldığında, TNFa uyarılmış hücrelerin TAT komplekslerinin yaklaşık iki katına çıkmasına neden oldu. Incirobilyaları 2: Kan endotel hücre odası modeli İşlevsellik. CHS olan veya olmayan (A), Chambers, tam kan ile inkübe edildi. CHS olmadan, bir pıhtı 30 dakika sonra kuruldu. CHS yokken kuluçkaya kanda trombin antitrombin (TAT) kompleksleri, pıhtılaşma dolaylı işaretleyici, ölçülmesi> 6000 ug / ml idi. (B), kan hacmi, farklı kan miktarı değişecektir, dönen hava kabarcığı hareket muhafaza. Bu 1.75 ml ilavesi ile 0.74 ml artacak ise kan 1.5 ml ilave edilmesiyle, bu hacim, 0.3 ml olacaktır. Konfluent tek tabaka faz kontrast mikroskopisi, tipik olarak endotel hücre morfolojisi önce (C), HUVEC görüntülü farklı kan hacimleri eklendiğinde kan teması. (D) tamamen CHS kaplı odaları için TAT değerleri hafif bir farklılık göstermektedir. 1.5 ml kan ilave 85 sonuçlandı 1.75 ml e ± 11 ug / ml (n = 7) göre 35 ile sonuçlanmıştır77; 70 ug / ml, TAT (s = 8). HUVEC aynı kan hacmi ile kuluçkaya yatırılır, bu fark, artık mevcut değildir; 1.5 ml 66 ± 55 ug / ml (n = 5) ve 66 ± 29 1.75 ml (n = 7), uyarılmamıştır ve TNFa ya da üzerinde CD16 + hücrelerinin sayısı. (D) miktarının belirlenmesi, mevcut sonra HUVECler uyarımlı için ug / ml kan teması. Ya da 1.75 ml (bazal:;: TNFa ya da 1.5 ml (256 ± 121 hücre / aa TNFa 100 ± 40 hücre / mm bazal) ile inkübe edilen hücreleri stimüle olan CD16 + hücre sayısı önemli ölçüde artmıştır 172 ± 67 hücre / mm; TNFa: tam kan, 378 ± 185 hücre / mm) (F), HUVEC falloidin (kırmızı için boyandı stimüle stimüle edilmemiş ve TNFa temsili görüntüleri), CD16 (yeşil) ve DAPI (mavi).. Ölçü bar = 250 um kan (1.5 mi ile inkübe edilen, tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla TAT komplekslerin formasyonu yaklaşık TNFa ile iki katına (G) hücreler uyarılmış. 2.1 ± 0.1 kat daha fazla TAT, n = 3; 1.75 mi: 1.7 ± 1.0 kat daha fazla TAT, n = 4). Tüm değerler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; p değerleri eşleşmemiş t testi ile hesaplanmıştır. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Kan ve damar duvarı arasında çok sayıda etkileşim nedeniyle normalde endotelyumun yapıştırıcı olmayan ve anti-trombotik yapılı bir hareketsiz bir halde muhafaza edilmektedir. ⁷ iltihabı kapsayan patolojik durumlar esnasında, endotel yapışma reseptör ifadesi ^8'de ortaya çıkan bir artış ile aktive edilir ve Bir yeteneği azalır inhibe hemostaz. sırayla kan kaskad sistemlerin ⁹ aktivasyonu daha tromboz ve lökosit neden endotel trombojenisiteyi güçlendirir. ¹⁰ endotelyal hücreler ve tam kandan arasındaki bu hassas etkileşimleri daha iyi bir anlayış kazanmak için, biz var kültürlenmiş endotel hücreleri, tam kan ile temas içinde yerleştirilir bir in vitro yöntem roman geliştirdi. Bildiğimiz kadarıyla, bizim kurulum daha uzun süreler için hiçbir ile tam insan kanı ya da çok az antikoagülan ile kuluçkaya endotel hücreleri göstermek için ilk.

nt "> Bu sistemin duyarlılığı kan ile temas halinde yerleştirilen tüm yüzeyler üzerinde immobilize heparin koruyucu bir tabaka ile kombinasyon halinde açık sistem delme ile etkinleştirilir., kan tedarik esnasında açık bir sistem kullanılması damar delinerek sırasında kademeli sistemlerinin aktivasyonu azaltır pıhtılaşma önleyici bir kendi kendine belirlenmiş bir miktarının kullanımına olanak iken. Ticari olarak temin edilebilen boşaltılmış kan tüplerinden Bununla birlikte, araştırmanın amaçlanan nihai noktalara bağlı olarak kullanılabilmektedir. piyasada bulunan kapalı bir sistem tüplere ilave antikoagülan nihai konsantrasyon duyarlı önleyebilir ve aksi sabit kurulumunda, etkileşimini incelemek. ⁶ koruyucu heparin yüzeyi, bundan başka, endotel hücreleri dışında herhangi bir yüzey ile yüzey teması kanın aktivasyonunu ortadan kaldırır. ⁵ Gerçekten de, fraksiyonlanmamış heparin, az miktarda ilave edilmiş tüm kanın inkübasyona CHS koruma olmadan oda pıhtı oluşmasına neden oldu.

<pSınıf = "jove_content"> hazne içerisindeki hava kabarcığı endotel hücreleri ile inkübasyon sırasında kan karıştırılmasını sağlar. Hava baloncuk büyüklüğünün etkisini değerlendirmek için, iki farklı kan hacmine kullanılır. Bu modelde, HUVEC ile inkübe odalarına bağımsız olarak hava kabarcığı boyutu içindeki TAT seviyeleri ölçüldü. TAT, ancak tam CHS daha küçük bir hava kabarcığı boyutu ile artan odaları muamele edilmiş oldu. Bu, daha önce tarif endotel hücre özellikleri ¹¹ uygun olarak, atıl CHS bölmesi içinde eksik olan endotel hücreleri tarafından sağlanan pıhtılaşmasının artması aktivasyonu üzerine düzenleyici bir etkisi gösterir. Sistemde hava kabarcığı bölmenin dönüş hareketi üzerine bir hava akımı yaratır. Balonun büyüklüğü bu dönen sistem içinde güçleri etkileyecektir. Bu küçük bir kabarcık, kan yani üzerine bir azalma kuvveti temsil eden yüksek TAT değerleri oluşturur Şekil 2B bizim sonuçlarla vardı gösterilir, kan hareketihaznesinin alt ve kaskadlı sistemin böylelikle aktivasyonu daha yüksek bir düzeye kadar ayrılması cereyan içinde. Bu sistemde, bizler, duvarlar ve merkezi düşük boyunca en yüksek hız ile bölmesi üzerinde hız farklı olacak bir döner akış oluşturma olduğu belirtilmelidir. Bu tabii ki endotel hücreleri için akış açısından ve makaslama kuvvetleri ile optimal bir ortam değil, ama yine de biz istikrarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar üreten bir sistem var. Diğer uygun koşullar türbülans olmadığında laminer akış sirkülasyon içerir. Bu, burada gösterilen modelde, ancak, mümkün değildir, bizim bilgimize göre, böyle bir sistem Şu an için mevcut değildir. , Sisteme eklenen antikoagülan için hiç veya düşük seviyeleri ile tam kan ile birleştirmek mümkün olmayan çok sayıda mikro-akışkan sistemleri piyasada mevcut olmasına rağmen bu şekilde, kan ve endotelyal hücrelerde bulunan tüm bileşenler arasındaki etkileşimlerin uygun hassas değerlendirilmesine olanak başarısız.

Ayrıca, TNFa, bağımsız bir kan hacminin TAT'ın bir kat oluşumu ile birlikte, HUVEC aktive yönelik kan hücrelerinin işe bir 2-kat daha yüksek olmuştur. Bu model sisteminin stabilitesini doğrular ve ayrıca, bütün kandan ile kombinasyon halinde bir aktive endoteli kullanma olasılığını göstermektedir. Kan endotel hücre bölmesi çeşitli koşullar ve aktivasyon safhaları altında hücreleri üzerinde ifade edilen markerler arasında çeşitli aktive edilmiş endotel hücrelerine karşı daha fazla kan hücre alımını incelemek için kullanılabilir Gelecekteki. Model ayrıca iltihaplı durumların üzerindeki etkileri değerlendirmek için yapılan farmakolojik maddeler ile kombinasyon halinde kullanılabilmektedir.

Özetle, biz vasküler hastalık ilgili araştırmalar yapmaya vitro sistemde tam bir beşer yaratacağım insan kanı ve damar hücreleri ile bir odası modeli birleştirerek büyük fayda göstermektedir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma n 602.699 (DIREKT) ° hibe sözleşmesi kapsamında İsveç Araştırma Konseyi (90.293.501, A0290401, A0290402), Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı hibe tarafından desteklenen, Novo Nordisk Vakfı, Gurli ve Edward Brunnberg Vakfı, Tedavi, Vleugel Kök Vakıf ve Åke Wiberg Vakfı.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)	PromoCell	C-12200	Any other type of primary human endothelial cell may be used.
Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)	PromoCell	C-22120
Gelatin	Sigma-Aldrich	G-2500	Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.
TAT ELISA	Enzyme Research Lab.	TAT-EIA-C
Mouse anti-human CD16	DAKO	F7011	Dilution 1:100
Goat anti-mouse Alexa 488	Molecular Probes	A11001	Dilution 1:500
Phalloidin-Texas Red	Molecular Probes	A22287	Dilution 1:200
DAPI	Molecular Probes	D1306	Dilution 10 μg/ml
EDTA	Sigma	E-6758
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco Life Tecnologies	25200-056
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437
1 well cell culture slides	BD Falcon	354101
Blood Chambers	NA	NA	Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS
Clamps	Office Depot	2052204
Corline Heparin Surface (CHS)	Corline Systems AB	945-00
Hypodermic needle	Terumo	NN-1850R	Size: 18 G x 5 mm
Unfractionated Heparin (UFH)	Leo Pharma	585679
K₃EDTA	Alfa Aesar	1709958	Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H₂0
PFA	Sigma-Aldrich	P-6148
Fluorescence microscope	Nikon	80i
Light microscope	Nikon	TS100
Image analysis software	Broad Institute	CellProfiler	Available for free at www.cellprofiler.org

References

Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology. J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).
Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin. Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).
Doctor, A., Spinella, P. Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In. Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).
Andersson, J., et al. Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro. J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).
Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).
Aird, W. C. Spatial and temporal dynamics of the endothelium. J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).
Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).
Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors. J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).
Esmon, C. T. Molecular circuits in thrombosis and inflammation. Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).
Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States. N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium. J. Vis. Exp. (93), e52112, doi:10.3791/52112 (2014).

Automatically Generated