רומן<em> במבחנה</em> מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל
Summary
The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).
Abstract
רוב של כל המחלות הידועות מלווים בהפרעות של מערכת הלב וכלי הדם. מחקרים לתוך המורכבות של מסלולי האינטראקציה מופעלים במהלך פתולוגיות לב וכלי דם, עם זאת, מוגבלים על ידי חוסר שיטות חזקות ורלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. על מנת לבנות מודל אירועים של כלי דם פתולוגיים שפיתחנו assay במבחנה לחקר יחסי הגומלין בין האנדותל וכל דם. Assay מורכב של תאים ראשוניים אדם אנדותל, אשר ממוקמים במגע עם דם כל אדם. השיטה משתמשת בדם האם של עם שום או מעט מאוד נוגד קרישה, המאפשרת מחקר של אינטראקציות עדינות בין מרכיבים מולקולריים ותאיים הנמצאים בכלי דם.
חקרנו את הפונקציונליות של assay על ידי השוואת הפעלה של קרישת דם במחזורים שונים הודגרו עם או בלי תאים אנושיים טבור אנדותל הווריד (HUVEC). ואילו גדול יותר נפח דם תרם לעלייה בהיווצרות של אנטי-טרומבין תרומבין מתחמים (TAT), נוכחות של HUVEC הביאו הפעלה מופחתת של קרישה. יתר על כן, אנחנו מוחלים ניתוח תמונה של קובץ מצורף לויקוציטים לHUVEC מגורה עם גורם נמק גידול (TNFα) ומצא את נוכחותו של CD16 + תאים להיות גבוה יותר באופן משמעותי על TNFα מגורה תאים בהשוואה לתאי unstimulated לאחר מגע דם. לסיכום, assay ניתן להחיל ללמוד פתולוגיות כלי דם, שבו אינטראקציות בין האנדותל ותא הדם מוטרדות.
Introduction
שיטות לניתוח אינטראקציות דם וכלי דם במחלות לב וכלי דם, בדרך כלל כרוכות בניסויי מחקר בבעלי החיים. תוצאות שנוצרו במודלים של בעלי חיים מחקר ניסיוניים עשויות, עם זאת, יש לי משמעות קטנה או לא למחלות בבני אדם. 1,2 ככזה, יש צורך בטוב ואמין במודלים חוץ גופית לחקור אינטראקציות הסלולר בין תא הדם ותאי האנדותל של כלי דם ב מערכת כמו בני-. לפיכך, אנו הקמנו מודל תא תא האנדותל דם. זה מבוסס על מודל שתואר קודם לכן לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין חומרים ביולוגיים וכל הדם אנושי. 3 בניגוד במבחנת הגדרות אחרות שבם בדרך כלל מוגבלת מספר הרכיבים מטוהרים, כלומר, טרומבוציטים, כדוריות דם לבנות או תאי האנדותל זמינים, המודל הנוכחי משלב את כל הרכיבים להציג בכלי דם.
ההתקנה של ג אנדותל הדםמודל קאמרי ell נועד לאפשר שימוש בדם אדם טרי נמשך עם נוגד קרישה הוסיפה מעט או ללא. הדם המאוחסן בפרקי זמן ארוכים יותר לרכוש כל כך נקרא נגעי אחסון שבו פירוט של אריתרוציטים עלול להפריע לאינטראקציות עדינות בין הדם ותאי האנדותל. 4
כדי להימנע מהיווצרות קריש דם במהלך הטיפול של דם מלא vivo לשעבר דורש גם מינונים גבוהים של נוגדי קרישה או שכל החומר במגע עם דם צריך להיות לא-הפעלה. כמשטחי הפעלה שאינן נדירים בסביבת המעבדה, חומרים עשויים לחלופין להיות מצוידים בשכבת מגן של הפרין המשותק. שכבת המגן של הפרין המשותק (להלן כפי משטח הפרין Corline (CHS)) שניתן להחיל את רוב חומרי יצירת משטח שבו קשר דם יכול להתרחש מבלי לגרום להפעלה של מפל הקרישה. 5 לכן, על ידי ריהוט החדרים עם CHS, ce אנדותל הדםll קאמרי מודל מאפשר שימוש בריכוזים נמוכים מאוד של נוגדי קרישה בדם. הימנעות התוספת של ריכוזים גבוהים של נוגד קרישה במודל תא אנדותל הדם מאפשרת לחקור אינטראקציות רגישות בתוך כלי דם שעלולים להיות רעול פנים. 6
מודל תא תא האנדותל דם מורכב משני תאים שנוצרו על ידי הצמדת גלילי פלסטיק (גובה: 8 מ"מ; רדיוס: 9 מ"מ) לשקופית מיקרוסקופ פלסטיק. הקצוות פונים כלפי מעלה על הצילינדרים מצוידים בחריצים שמצוידים בטבעות אטימות מגומי המשמשות לאיטום התאים נגד שקופיות תרבית תאים. התאים מלאים באופן חלקי בלבד עם דם כמו האוויר שנשאר בתא שומר דם בתנועה כאשר התאים מסובבים לאחר מכן במצב אנכי (איור 1).
על מנת להעריך את התפקוד של המודל, ביצענו ניסויים עם או לחלוטין CHS מצופהתאי תא או טבור אדם וריד האנדותל (HUVEC). שני כרכי דם נפרדים היו assayed והיווצרות של אנטי-טרומבין תרומבין (TAT) מתחמים (סמן עקיף של קרישה) נמדדה עם assay אנזים קשור immunosorbent (ELISA). לאחר מכן, אנו הערכנו את ההשפעה של כמויות דם וגורם נמק גידול (TNFα) מגורה בתאי האנדותל בגיוס לויקוציטים על ידי ניתוח תמונה.
איור 1. הגדרה של מודל תא תא האנדותל דם. (א) למעלה להציג ציור סכמטי של תא הדם שנעשה בPMMA. תאי האנדותל אנושיים יסודיים (ב ') בתרבית על שקופיות קאמריות 1 היטב. כל דם אדם טרי מתווסף לשני תאים בשקופית מיקרוסקופ. מטופלים התאים וכל החומר המשמשים לטיפול בדם עם ציפוי HS מגן. לאחר הסרת קירות לסה"נשקופית תרבות LL, התאים ממוקמות מול הדם והמערכת תהיה סגורה בחוזקה. לאחר מכן תאי תא (C) אנדותל הדם מודגרת תחת סיבוב ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, התגובות בתא הדם עשויים להיות מנותחות על ידי ELISA ותאי האנדותל יכולים להיות מנותחים על ידי מיקרוסקופי.
Protocol
Representative Results
Discussion
אינטראקציות רבות בין הדם ודופן כלי דם הן בדרך כלל נשמרו במצב שקט בשל האופי הלא דביק ואנטי-טרומבוטיים של האנדותל. 7 במצבים פתולוגיים כוללים דלקת, האנדותל מופעל עם עלייה וכתוצאה מכך ביטוי הקולטן הידבקות 8 ו יכולת מופחתת לעכב עצירת דימום. 9 הפעלה של מערכות המפל בדם בתורו מגבירה את thrombogenicity של האנדותל גורמת גיוס פקקת וויקוציטים נוספים. 10 כדי להשיג הבנה טובה יותר של יחסי גומלין עדינים בין תאי האנדותל וכל דם, שיש לנו פיתח רומן בשיטה חוץ גופית שבו תאי אנדותל בתרבית ממוקמים במגע עם דם כל. למיטב ידיעתנו, ההגדרה שלנו היא הראשון שהראתה תאי האנדותל מודגרות עם כל דם אנושי עם שום או נוגד קרישה מעט מאוד לתקופות זמן ארוכות יותר.
NT "> הרגישות של מערכת זו מופעלת על ידי venipuncture מערכת הפתוח בשילוב עם שכבת המגן של הפרין משותק על כל המשטחים הונחו במגע עם דם. השימוש במערכת פתוחה ברכש דם מפחיתה את ההפעלה של מערכות המפל במהלך venipuncture תוך התרת השימוש בסכום שנקבע עצמי של נוגדי קרישה. ייתכן, עם זאת, לשמש צינורות דם פונו זמינים מסחרי בהתאם לנקודות הקצה המיועדים של המחקר. הריכוז הסופי של נוגד קרישה הוסיף לצינורות מערכת הסגורים ביותר הזמינים מסחרי עלולים לעכב רגיש , ואחרת קשה ללמוד, אינטראקציות בהתקנה. 6 משטח הפרין מגן נוסף מבטל הפעלה של דם דרך שטח מגע על ידי כל משטחים אחרים מאשר תאי האנדותל. 5 ואכן, דגירה של דם מלא בתוספת כמות קטנה של הפרין unfractionated ב חדר ללא ההגנה של CHS הביא להיווצרות קרישים. <pclass = "jove_content"> בועת האוויר בתוך החדר מאפשרת ערבוב של הדם במהלך דגירה עם תאי האנדותל. על מנת להעריך את ההשפעה של גודל בועת האוויר, השתמשנו בשני כרכי דם שונים. במודל זה, מדדנו רמות TAT דומות ללא קשר לגודל בועת אוויר בתאים הודגרו עם HUVEC. TAT היה, לעומת זאת, גדל עם גודל בועת האוויר קטן יותר ברגישות היתר לאלרגיה באופן מלא טופל תאים. זה, בהתאם למאפייני תא אנדותל שתוארו קודם לכן 11, מצביע על השפעה רגולציה על ההפעלה המוגברת של קרישה הניתנת על ידי תאי האנדותל שחסר בחדר CHS אינרטי. בועת האוויר במערכת יוצרת זרימה על מחזור של החדר. גודלה של הבועה ישפיע על הכוחות בתוך מערכת זו מסתובבת. זה מוצג על ידי התוצאות שלנו באיור 2 ד היו בועה קטנה יוצרת ערכי TAT גבוהים המייצגים כוח ירד על כלומר הדם, זרימת הדםבתוך התא הוא נמוך יותר ובכך שהפעיל מערכת המפל מתרחש למידה גבוהה יותר. יש לציין כי במערכת זו אנו יוצרים זרימה מסתובבת שתהיה שונים במהירות על פני החדר עם המהירות הגבוהה ביותר לאורך הקירות, והנמוך ביותר במרכז. זה כמובן לא סביבה אופטימלית בכל קשורה לזרימה ולחץ גזירה לתאי אנדותל, אבל עדיין יש לנו מערכת הפקת תוצאות יציבה ודיר. תנאים יותר אופטימליים יכללו במחזור הזרימה למינרית בהעדר המערבולת. זהו, עם זאת, לא ניתן במודל המיוצג כאן ולידיעתנו על מערכת כזו היא לא זמינה עד כה. אמנם, יש כמה מערכות מייקרו-נוזליות זמין מסחרית שאינן ניתן לשלב עם כל דם נמוך עם שום או רמות של נוגד קרישה נוספה למערכת ובכך נכשל כדי לאפשר הערכה נאותה רגישה של יחסי הגומלין בין כל הרכיבים הנמצאים בדם ותאי האנדותל.יתר על כן, חלה עלייה של פי 2 בגיוס של תאי דם לכיוון TNFα מופעל HUVEC בשילוב עם היווצרות הוכפלה של תאת באופן בלתי תלויה בנפח הדם. זה מוודא את יציבות של מערכת המודל וגם מראה את האפשרות להשתמש האנדותל מופעל בשילוב עם כל דם. עתיד על, תא התא האנדותל דם יכול לשמש כדי לחקור גיוס תאי דם לכיוון תאי האנדותל המופעלים על ידי מגוון רחב של סמנים הביעו על תאים בתנאים ובשלבי הפעלה שונים. יתר על כן, המודל יכול לשמש בשילוב עם סוכנים תרופתיים על מנת לבדוק את ההשפעות על מצבים דלקתיים.
לסיכום, אנו מציגים את היתרון הגדול של שילוב מודל קאמרי עם תאי דם וכלי דם אנושיים כדי ליצור אדם שלם במערכת חוץ גופית לבצע חקירות רלוונטיות למחלות כלי דם.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה השבדית למחקר (90293501, A0290401, A0290402), השביעית תכנית המסגרת של הקהילה האירופית במסגרת הסכם מענק N ° 602,699 (Direkt), קרן NovoNordisk, Brunnberg קרן Gurli ואדוארד, גזע תרפיה, Vleugel קרן וÅke Wiberg קרן.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20 |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
References
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology. J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin. Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).
- Doctor, A., Spinella, P. Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In. Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).
- Andersson, J., et al. Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro. J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).
- Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).
- Aird, W. C. Spatial and temporal dynamics of the endothelium. J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).
- Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors. J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).
- Esmon, C. T. Molecular circuits in thrombosis and inflammation. Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States. N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
