Роман<em> В пробирке</em> Модель для изучения взаимодействия между человеческим цельной крови и эндотелия
Summary
The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).
Abstract
Большинство из известных болезней, которые сопровождаются расстройствами сердечно-сосудистой системы. Исследования в сложности взаимодействующих путей, активированных в течение сердечно-сосудистых патологий, однако, ограничен из-за отсутствия надежных и физиологически соответствующих методов. Для моделирования патологических событий сосудистых мы разработали анализ в пробирке для изучения взаимодействия эндотелия и цельной крови. Анализ состоит из первичных человеческих эндотелиальных клеток, которые размещены в контакте с цельной крови человека. Способ использует встроенную кровь без каких-либо очень мало или антикоагулянтом, что позволяет изучение тонких взаимодействий между молекулярных и клеточных компонентов, присутствующих в кровеносном сосуде.
Мы исследовали функциональные возможности анализа путем сравнения активации свертывания по различных объемов крови инкубировали с или без пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC). В то время как больший объем крови способствовалиувеличение в образовании тромбина антитромбин (ТАТ) комплексы, наличие HUVEC привело к снижению активации свертывания. Кроме того, мы применили анализ изображения прикрепления лейкоцитов к HUVEC, стимулированных фактора некроза опухоли (ФНО) и обнаружили присутствие CD16 + клеток, что значительно выше, на ФНО стимулированных клеток по сравнению с стимулированных клеток после контакта с кровью. В заключение, анализ может быть применен для изучения сосудистых патологий, где взаимодействие между эндотелием и отсек крови возмущенные.
Introduction
Методы анализа крови-сосудистой взаимодействия в сердечно-сосудистых заболеваний обычно включают научно-исследовательские эксперименты на животных. Результаты, созданные в экспериментальных моделях на животных исследования могут, однако, практически не имеют последствий для заболевания человека. 1,2 Таким образом, существует потребность в хорошим и надежным в пробирке моделей для исследования клеточных взаимодействий между отсеке крови и сосудистых эндотелиальных клеток в человек-как. Поэтому мы создали клетки камерный модель эндотелия в крови. Это основано на ранее описанной модели, используемой для исследования взаимодействия между биоматериалов и цельной крови человека. 3 В отличие от других установок в пробирке, где, как правило, ограниченное количество очищенных компонентов, то есть, тромбоциты, лейкоциты или эндотелиальные клетки доступны, присутствует модель включает все компонентов, присутствующих в кровеносный сосуд.
Настройка эндотелиальной крови сELL камера модель предназначена для использования других свеженарисованного крови человека с небольшим или без добавления антикоагулянта. Кровь хранится в течение более длительных периодов времени приобретают так называемые очаги хранения, где разбивка эритроцитов могут помешать деликатных взаимодействия между кровью и эндотелиальных клеток. 4
Чтобы избежать образование тромбов во время обработки цельной крови экс естественных требует либо высокие дозы антикоагулянта или, что все материалы в контакте с кровью должны быть не активирующий. Как не-активирующие поверхности редки в лабораторных условиях, в качестве альтернативы материалы могут быть снабжены защитным слоем иммобилизованного гепарина. Защитный слой иммобилизованного гепарина (далее именуемые как гепарин Corline поверхности (CHS)), которые могут быть применены к большинству материалов создания поверхности контакта, где кровь может происходить, не вызывая активацию каскада свертывания. 5 Таким образом, путем предоставления камер с CHS, эндотелия крови сеLL камера модель позволяет использовать очень низких концентрациях антикоагулянта в крови. Как избежать добавление высоких концентраций антикоагулянта в камере модели эндотелиальной крови делает возможным изучать чувствительные взаимодействия внутри кровеносного сосуда, что в противном случае может быть замаскирован. 6
Клетка камера модель эндотелия крови состоит из двух палат, образованных путем присоединения пластиковые цилиндры (высота: 8 мм; радиус: 9 мм) до пластиковой микроскопа. Края, стоящие вверх на цилиндрах оснащены пазами, которые оснащены резиновыми уплотнительными кольцами, используемых для герметизации камер против культивирования клеток горкой. Камеры лишь частично заполнены кровью, как воздух остается в камере удерживает кровь в движение, когда камеры впоследствии поворачивается в вертикальное положение (рис 1).
Для того чтобы оценить функциональность модели, были проведены эксперименты с либо полностью CHS покрытиемкамерные или пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC). Две отдельные объемы крови анализировали и образование тромбина антитромбин (ТАТ) комплексов (непрямого маркера коагуляции) было измерено с твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Мы тогда оценивали влияние объемов крови и фактора некроза опухоли (ФНО) стимулировали эндотелиальные клетки на вербовке лейкоцитов анализом изображений.
Рисунок 1. Установка в ячейки камеры модели эндотелия в крови. (А) Вид сверху схематическое изображение камеры крови, достигнутый в ПММА. (B) Первичные эндотелиальные клетки человека культивируют на слайдах камеры 1-а. Свежий цельной крови человека добавляется в двух камерах на предметное стекло микроскопа. Камеры и все материалы, используемые для обработки крови, рассматриваются с защитным HS покрытия. После удаления стены сеLL культура слайд, клетки помещают перед кровь и система зажимается на замке. (С) эндотелиальных клеток крови камеры затем инкубируют при вращении в 37 ° С. После этого реакции в отсеке крови могут быть проанализированы с помощью ELISA и эндотелиальные клетки могут быть проанализированы с помощью микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Множественные взаимодействия между кровью и стенкой сосуда, как правило, поддерживают в состоянии покоя в связи с неклейкой и анти-тромботической природы эндотелия. 7 Во патологических состояний, связанных с воспалением, эндотелий активирован с результирующим увеличением адгезии рецепторов выражения 8 и снижается способность ингибировать гемостаз. 9 Активация каскада систем в крови в свою очередь усиливает тромбогенности эндотелия приводит к дальнейшему тромбоз и лейкоцитов вербовки. 10 Для лучшего понимания этого деликатных взаимодействия между эндотелиальных клеток и цельной крови, у нас есть разработаны роман в методе экстракорпорального где культивированные эндотелиальные клетки в контакт с цельной крови. Насколько нам известно, наши установки является первым, чтобы показать эндотелиальные клетки инкубировали с целой человеческой крови с отсутствием или очень мало антикоагулянта для более длительных периодов времени.
нт "> Чувствительность этой системы включен по открытой системы венепункции в сочетании с защитным слоем иммобилизованного гепарина на всех поверхностях, расположенных в контакте с кровью. Использование открытой системы закупок в течение крови уменьшает активацию каскадных систем во венепункции в то время позволяя использовать само-определяется количеством антикоагулянта. Коммерчески доступные эвакуированные пробирки крови, однако, может быть использован в зависимости от предполагаемого конечного точек исследования. Конечная концентрация антикоагулянта добавлен к наиболее коммерчески доступных замкнутой системе труб может ингибировать чувствительны , а в противном случае трудно изучить, взаимодействие в установке. 6 защитную поверхность гепарина дополнительно устраняет активацию крови через поверхностный контакт любыми другими, чем эндотелиальных клеток поверхностей. 5 Действительно, инкубации цельной крови с добавлением небольшого количества нефракционированного гепарина в Камера без защиты CHS привело к образованию сгустка. <pкласс = "jove_content"> пузырь воздуха внутри камеры обеспечивает смешивание крови во время инкубации с эндотелиальными клетками. Для того чтобы оценить влияние размера пузырьков воздуха, мы использовали два разных объемов крови. В этой модели, мы измерили аналогичные уровни ТАТ, независимо от размера воздушного пузыря в камерах инкубированными с ЭКПВЧ. ТАТ был, однако, увеличивается с меньшим размером пузырьков воздуха в полностью CHS лечить камеры. Это, в соответствии с ранее описанными эндотелиальных клеток свойствами 11, указывает, регулирующий воздействие на повышенной активации свертывания, представленной на эндотелиальных клетках, что отсутствует в инертной CHS камере. Пузырь воздуха в системе создает поток при вращении камеры. Размер пузырьков будет влиять на силы внутри этой вращающейся системе. Это показано с помощью наших результатов на фиг.2d были меньше пузырь создает более высокие значения, представляющие ТАТ уменьшенную силу по IE крови, движение кровиВнутри камеры ниже, и, таким образом, активацию каскада системы происходит в большей степени. Следует отметить, что в этой системе мы создаем вращающийся поток, который будет отличаться в скорости по камере с высокой скоростью вдоль стен и самый низкий в центре. Это, очевидно, не является оптимальным среда с учета потоков и напряжения сдвига для эндотелиальных клеток, но все же у нас есть система получения устойчивых и воспроизводимых результатов. Более оптимальные условия включают ламинарный поток циркулирующего в отсутствие турбулентности. Это, однако, не представляется возможным в модели, представленной здесь, и, насколько нам известно, такие системы не доступна на сегодняшний день. Хотя существует несколько микрофлюидальные системы доступны коммерчески, которые не можно комбинировать с цельной крови без каких-либо или низких уровней антикоагулянта добавлен к этому система не обеспечит правильную чувствительную оценку взаимодействий между всеми компонентами, присутствующими в крови и эндотелиальных клеток,Кроме того, было увеличение в 2 раза в наборе клеток крови в сторону ФНО активирована HUVEC в комбинации с удвоенной формирования ТАТ независимо от объема крови. Это подтверждает стабильность модельной системе, а также показывает возможность использовать активированный эндотелий в сочетании с цельной крови. Будущие на, камера эндотелиальных клеток крови может быть использован для изучения набора клеток крови в сторону активированных эндотелиальных клеток с помощью различных маркеров на клетках, выраженных в различных условиях и этапах активации. Кроме того, модель может быть использована в сочетании с фармакологическими агентами, чтобы оценить воздействие на воспалительные состояния.
Таким образом, мы показываем большую пользу объединения камерный модель человеческой кровью и сосудистых клеток, чтобы создать полную человека в системе экстракорпорального выполнять соответствующие исследования сосудистых заболеваний.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Шведского исследовательского совета (90293501, A0290401, A0290402), Седьмой рамочной программы Европейского сообщества по договору безвозмездной N ° 602699 (директ), НовоНордиск Фонд, Gurli и Эдвард Brunnberg Фонд, стволовых терапия, Vleugel Фонд и Оке Виберг Фонд.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20 |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
References
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology. J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin. Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).
- Doctor, A., Spinella, P. Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In. Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).
- Andersson, J., et al. Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro. J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).
- Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).
- Aird, W. C. Spatial and temporal dynamics of the endothelium. J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).
- Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors. J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).
- Esmon, C. T. Molecular circuits in thrombosis and inflammation. Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States. N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
