رواية<em> في المختبر</em> نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium
Summary
The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).
Abstract
ويرافق غالبية من جميع الأمراض المعروفة من قبل اضطرابات في نظام القلب والأوعية الدموية. دراسات في تعقيد سبل تفعيلها خلال التفاعل أمراض القلب والأوعية الدموية و، ومع ذلك، محدودة بسبب عدم وجود طرق قوية وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. من أجل نمذجة الأحداث الأوعية الدموية المرضية قمنا بتطوير فحص في المختبر لدراسة التفاعل بين البطانة والدم كله. ويتكون الفحص من الخلايا البطانية الإنسان الأساسية، والتي يتم وضعها في اتصال مع الدم البشري كله. يستخدم أسلوب دم الأم مع أي أو القليل جدا من تخثر، مما يتيح دراسة التفاعلات الحساسة بين المكونات الجزيئية والخلوية الموجودة في الأوعية الدموية.
نحن التحقيق ظيفة الفحص بمقارنة تفعيل تخثر الدم بواسطة أحجام مختلفة المحتضنة مع أو بدون خلايا بطانة الوريد السري الإنسان (HUVEC). في حين ساهم حجم الدم أكبر ل(TAT) المجمعات، أدى إلى زيادة في تكوين الثرومبين مضاد الثرومبين جود HUVEC في خفض تفعيل التخثر. وعلاوة على ذلك، طبقنا تحليل صورة مرفق الكريات البيض إلى HUVEC حفز مع عامل نخر الورم (TNFα) وجدت وجود CD16 + الخلايا لتكون أعلى بكثير على TNFα حفز الخلايا بالمقارنة مع الخلايا unstimulated بعد ملامسة الدم. في الختام، الفحص يمكن تطبيقها لدراسة أمراض الأوعية الدموية، حيث يتم مضطرب التفاعلات بين البطانة ومقصورة الدم.
Introduction
طرق لتحليل التفاعلات الدم في الأوعية الدموية أمراض القلب والأوعية الدموية تشمل عموما تجارب البحوث الحيوانية. قد النتائج التي تم إنشاؤها في النماذج الحيوانية الأبحاث التجريبية، ومع ذلك، فقد ضمنا ضئيلة أو معدومة للأمراض البشرية. 1،2 على هذا النحو، هناك حاجة للخير وموثوق بها في النماذج المختبرية للتحقيق في التفاعلات الخلوية بين مقصورة الدم والخلايا البطانية الوعائية في نظام يشبه الإنسان. وبالتالي أنشأنا البطانية الدم نموذج غرفة الخلية. ويستند هذا على نموذج سبق وصفها تستخدم لتحقيق التفاعل بين المواد الحيوية والدم البشري كله. 3 خلافا لغيرها من الاجهزة في المختبر حيث عادة عدد من المكونات النقية، محدودة أي thrombocytes، هي الكريات البيضاء أو الخلايا البطانية المتاحة، والنموذج الحالي يتضمن جميع مكونات موجودة في الاوعية الدموية.
الإعداد للالبطانية الدم جتم تصميم نموذج الذراع الغرفة لتمكين استخدام رسمها الدم البشري الطازج مع القليل أو لا تخثر المضافة. الدم المخزنة خلال فترات زمنية أطول يكتسب ما يسمى الآفات التخزين حيث انهيار الكريات الحمراء قد تتداخل مع التفاعلات الحساسة بين الدم والخلايا البطانية. 4
لتجنب تشكل جلطة أثناء التعامل مع الدم خارج الجسم كله يتطلب إما جرعات عالية من مضادات التخثر أو أن جميع المواد في اتصال مع الدم يجب أن تكون غير تفعيل. كما الأسطح غير تفعيل نادرة في بيئة معملية، قد تكون مجهزة بدلا من المواد مع طبقة واقية من الهيبارين يجمد. طبقة واقية من الهيبارين يجمد (المشار إليه فيما Corline الهيبارين السطحية (كلية العلوم الصحية)) والتي يمكن تطبيقها على معظم المواد خلق السطح حيث يمكن أن يحدث تلامس الدم دون التسبب في تفعيل شلال التخثر. 5 وهكذا، من خلال تأثيث غرف مع كلية العلوم الصحية، وم البطانية الدمليرة لبنانية نموذج غرفة يتيح استخدام تركيزات منخفضة جدا من تخثر في الدم. تجنب إضافة تركيزات عالية من تخثر في الدم طراز الغرفة البطانية يجعل من الممكن لدراسة التفاعلات الحساسة داخل الأوعية الدموية التي قد تكون على خلاف ذلك ملثمين 6
يتكون الدم البطانية نموذج غرفة خلية من مجلسين شكلتها إرفاق اسطوانات البلاستيك (الطول: 8 مم؛ نصف قطرها: 9 مم) إلى المجهر الشريحة البلاستيكية. مجهزة الحواف التي تواجه صعودا على اسطوانات مع الأخاديد التي يتم تركيبها مع المطاط O-خواتم تستخدم لاغلاق الدوائر ضد الشريحة ثقافة الخلية. تمتلئ غرف جزئيا فقط مع الدم والهواء ترك في الغرفة وتبقي الدم في الحركة عندما يتم استدارة غرف لاحقا في وضع عمودي (الشكل 1).
من أجل تقييم الأداء الوظيفي للنموذج، أجرينا تجارب إما مع كلية العلوم الصحية المغلفة تماماغرفة أو الوريد السري الإنسان خلايا غشائي (HUVEC). وقد يعاير مجلدين منفصلين الدم وقياس تشكيل الثرومبين مضاد الثرومبين (TAT) مجمعات (علامة غير مباشرة للتخثر) مع انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA). نحن بعد ذلك بتقييم تأثير حجم الدم وعامل نخر الورم (TNFα) حفز الخلايا البطانية على تجنيد الكريات البيض بواسطة تحليل الصور.
الشكل 1. الإعداد للالبطانية الدم نموذج غرفة الخلية. (A) أعلى عرض الرسم التخطيطي للغرفة الدم المحرز في PMMA. (ب) الخلايا البطانية الإنسان الأولية هي تربيتها على 1-جيدا الشرائح غرفة. وأضاف العذبة الدم البشري كله إلى مجلسين على شريحة المجهر. يتم التعامل مع الدوائر وجميع المواد المستخدمة للتعامل مع الدم مع طلاء واقية HS. بعد إزالة جدران مليرة لبنانية ثقافة شريحة، يتم وضع الخلايا التي تواجه الدم وفرضت نظام الإغلاق. ثم يتم تحضين غرف الخلية (C) في الدم تحت البطانية في دوران 37 درجة مئوية. بعد ذلك، يمكن تحليل ردود الفعل في مقصورة الدم عن طريق ELISA ويمكن تحليل الخلايا البطانية بواسطة المجهر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم الاحتفاظ التفاعلات المتعددة بين الدم وجدار الوعاء الدموي عادة في حالة هادئة نظرا لطبيعتها غير لاصقة ومكافحة الجلطات من البطانة. 7 خلال الحالات المرضية التي تشمل التهاب، يتم تنشيط البطانة مع الزيادة الناتجة في التصاق مستقبلات التعبير 8 و القدرة على خفض تمنع الارقاء. 9 تفعيل أنظمة شلال في الدم بدوره تضخيم thrombogenicity من البطانة التسبب في مزيد من تجلط الدم والكريات البيض التوظيف. 10 للحصول على فهم أفضل لهذه التفاعلات الحساسة بين الخلايا البطانية والدم كله، لدينا وضعت الرواية في طريقة المختبر حيث يتم وضع الخلايا البطانية مثقف في اتصال مع دم بأكمله. على حد علمنا، والإعداد لدينا هو الأول لإظهار الخلايا البطانية المحتضنة مع الدم البشري كله مع عدم وجود تخثر أو القليل جدا لفترات زمنية أطول.
يتم تمكين NT "> إن حساسية هذا النظام عن طريق بزل الوريد نظام مفتوح في تركيبة مع طبقة واقية من الهيبارين ثبتوا على جميع الأسطح وضعت في اتصال مع الدم. إن استخدام نظام مفتوح خلال شراء الدم يقلل من تفعيل أنظمة شلال خلال بزل الوريد في حين السماح باستخدام كمية تحددها الذات من تخثر. ومع ذلك، قد تكون استخدمت المتاحة تجاريا أنابيب الدم اجلاء اعتمادا على نقطة نهاية المقصود من هذه الدراسة، وتركيز النهائي من تخثر تضاف إلى أنابيب مغلقة نظام أكثر المتاحة تجاريا قد تمنع الحساسية وخلاف ذلك من الصعب للدراسة، التفاعلات في الإعداد. 6 يقضي على سطح الهيبارين واقية مزيد تفعيل الدم عن طريق الاتصال من قبل أي سطح السطوح الأخرى من الخلايا البطانية. 5 وفي الواقع، حضانة الدم الكامل تستكمل مع كمية صغيرة من الهيبارين غير المجزأ في أسفرت الغرفة دون حماية من كلية العلوم الصحية في تكوين الجلطة. <pالطبقة = "jove_content"> فقاعة الهواء داخل الغرفة يمكن خلط الدم أثناء الحضانة مع الخلايا البطانية. من أجل تقييم تأثير حجم فقاعة الهواء، وكنا مجلدين الدم المختلفة. في هذا النموذج، قمنا بقياس مستويات TAT مماثلة بغض النظر عن حجم فقاعة الهواء في غرف المحتضنة مع HUVEC. كان TAT، ولكن، مع زيادة حجم أصغر فقاعة الهواء في كلية العلوم الصحية بالكامل تعامل الدوائر. هذا، وفقا لسبق وصفها خصائص الخلايا البطانية 11، يشير إلى وجود تأثير تنظيمي على تفعيل زيادة التخثر التي تقدمها الخلايا البطانية التي تفتقر في قاعة كلية العلوم الصحية الخاملة. فقاعة الهواء في نظام يخلق تدفق على دوران الغرفة. فإن حجم فقاعة تؤثر على القوى داخل هذا النظام بالتناوب. ويظهر ذلك من خلال نتائجنا في الشكل 2D كانت فقاعة صغيرة تخلق TAT القيم الأعلى تمثل قوة انخفضت على سبيل المثال الدم، وحركة الدمداخل غرفة أقل وبالتالي تفعيل نظام شلال يحدث إلى حد أعلى. وتجدر الإشارة إلى أنه في هذا النظام ونحن على خلق تدفق الدورية التي سوف تكون مختلفة في سرعة عبر الغرفة مع أعلى سرعة على طول الجدران وأدناها في المركز. ومن الواضح أن هذا لا يشكل بيئة مثلى فيما يتعلق بالتدفق وإجهاد القص للحصول على الخلايا البطانية، ولكن لا يزال لدينا نظام تحقيق نتائج مستقرة وقابلة للتكرار. ستشمل ظروف أكثر المثلى تعميم تدفق الصفحي في غياب الاضطرابات. هذا هو، ومع ذلك، لا يمكن في النموذج الممثلة هنا وعلى حد علمنا هذا النظام غير متوفر حتى الآن. على الرغم من ذلك، هناك العديد من النظم المتاحة تجاريا ميكروفلويديك التي لا يمكن أن تتحد مع الدم كله مع عدم وجود أو انخفاض مستويات تخثر إضافتها إلى النظام وبالتالي تفشل في تمكين تقييم حساسية السليم للتفاعلات بين جميع المكونات موجودة في الدم والخلايا البطانية.وعلاوة على ذلك، كانت هناك زيادة بنسبة 2 أضعاف في تجنيد خلايا الدم نحو TNFα تنشيط HUVEC في توليفة مع تشكيل تضاعف من TAT بشكل مستقل من حجم الدم. هذا يتحقق استقرار النظام النموذج ويظهر أيضا إمكانية استخدام البطانة تفعيلها بالاشتراك مع الدم الكامل. على المستقبل، غرفة الخلية البطانية الدم يمكن استخدامها لتحقيق تجنيد خلايا الدم نحو الخلايا البطانية تفعيلها من خلال مجموعة متنوعة من العلامات أعرب عن الخلايا تحت مختلف الظروف والمراحل التنشيط. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج يمكن أن تستخدم في تركيبة مع وكلاء الدوائية من أجل تقييم الآثار المترتبة على حالات الالتهابات.
باختصار، نقدم لك مجموعة من فائدة عظيمة للجمع بين نموذج الغرفة مع خلايا الدم والأوعية الدموية البشرية لخلق إنسان كامل في نظام المختبر لإجراء تحقيقات ذات الصلة من أمراض الأوعية الدموية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من المجلس السويدي للبحوث (90293501، A0290401، A0290402)، البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية بموجب اتفاقية المنحة رقم 602699 (DIREKT)، ومؤسسة NovoNordisk، ومؤسسة Gurli وإدوارد Brunnberg، الجذعية العلاج، Vleugel مؤسسة ومؤسسة آك WIBERG.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20 |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
References
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology. J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin. Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).
- Doctor, A., Spinella, P. Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In. Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).
- Andersson, J., et al. Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro. J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).
- Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).
- Aird, W. C. Spatial and temporal dynamics of the endothelium. J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).
- Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors. J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).
- Esmon, C. T. Molecular circuits in thrombosis and inflammation. Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States. N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
