Derivación de células cardiacas progenitoras a partir de células madre embrionarias

Las enfermedades del corazón siguen siendo la causa principal en el mundo de hoy y las tasas de mortalidad se han mantenido prácticamente sin cambios en las últimas dos décadas (American Heart Association). Hay una necesidad crítica para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para prevenir o revertir la insuficiencia cardíaca con eficacia. Una estrategia prometedora es la terapia basada en células tras el rápido desarrollo de la biología de células madre ^1. En este sentido, las CPC multipotentes podrían ser una fuente de células excelente para la terapia debido a su capacidad para proliferar, pero cometido sólo a la diferenciación de linaje cardiaco. Por lo tanto, el método eficiente y robusto para generar y aislar CPC es de gran importancia para los estudios de terapia celular cardiaca.

Este protocolo se centra en CPC embrionarias identificados durante la embriogénesis temprana y cómo su generación a partir de los CES. Varios CPC han sido aislados de corazones embrionarias y adultas, incluso desde médulas óseas ^2. Durante el desarrollo embrionario, morphoge huesoproteínas magnéticos (BMP), de tipo alas miembros de la familia del sitio de integración MMTV (Wnts) y nodal señales inducen el compromiso de la Mesp1 ⁺ mesodermo multipotentes ^3. Células Mesp1 ⁺ luego se diferencian en los CPC embrionarias ^4. Estos CPC están típicamente marcados por HCN4, NK2 homeobox 5 (Nkx2-5), Isl LIM homeobox 1 (ISL1), T-box 5 (Tbx5), y miocitos factor de promotor de 2C (MEF2C), forman campos cardíacos primarios y segundo, y contribuir a las partes principales de corazón durante cardiogénesis ^5-10. CPC Tanto Nkx2-5 ⁺ y ISL1 ⁺ / ⁺ MEF2C son capaces de diferenciarse en cardiomiocitos, células musculares lisas (CML), y células endoteliales ^5-8. Así, estas CPC dará lugar a la vasculatura cardiaca, así como tejidos cardíacos y son una fuente de células ideal para la terapia del corazón basado en células. En consecuencia, la generación de CPC in vitro ha sido un foco importante de investigación en estudios cardiovasculares. Desde CES tienen la expansión ilimitada capacidad de unnd representan las células ICM en la etapa de blastocisto, la diferenciación de los CES en CPC embrionarias después de la embriogénesis natural se considera un enfoque lógico y eficaz para obtener los CPC.

Un enfoque ampliamente aplicada para obtener los CPC de los CES es agregar los CES en EBS ^11. Para mejorar la eficiencia de diferenciación, se han utilizado factores químicos y de crecimiento definidos basados ​​en el conocimiento de desarrollo cardíaco ^12-14. Sin embargo, no hay marcadores CPC definitivas, en particular no hay marcadores de la superficie celular, que son ampliamente aceptados en el campo. Para solucionar este problema, los CES están diseñados para marcar ISL1 ⁺ o MEF2C CPC ⁺ y sus derivados con los reporteros fluorescentes utilizando el sistema Cre / loxP. La recombinasa cre es eliminado en bajo el control de ISL1 / MEF2C promotor / potenciador. Modificado RFP proteína fluorescente o un gen YFP impulsado por un promotor constitutivo se pueden activar por escisión de codón de parada flox con recombinasa cre(ISL1: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP o RFP / ISL1 cre-; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP) ^5,6. Una vez que los CES se diferencian en CPC segundo campo corazón, ISL1 / MEF2C promotor / potenciador cre impulsado activará los reporteros fluorescentes y los CPC puede ser enriquecida por FACS-purificación. Brevemente, el método de agregación EB se utiliza para iniciar la diferenciación de ESC. Para mejorar la eficiencia de diferenciación, las células diferenciadas se tratan con ácido ascórbico (AA) y factores de crecimiento tales como Bmp4, activina A y VEGF ^13,15. Este protocolo permite robusto y eficiente la diferenciación CPC usando ratón y humanos CES.