Вывод сердца клеток-предшественников из эмбриональных стволовых клеток
Summary
In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.
Abstract
Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему ведущей причиной смертности в мире сегодня, и уровень смертности остается практически неизменным в течение последних двух десятилетий (Американская ассоциация сердца). Существует острая необходимость в разработке новых терапевтических стратегий для эффективного предотвращения или обратить вспять сердечной недостаточности. Одним из перспективных стратегия клеточной терапии после бурного развития биологии стволовых клеток 1. В связи с этим, мультипотентных ЦЧП может быть отличным источником клеток для лечения из-за их способности к пролиферации, но совершено только клонов дифференциации сердечной. Таким образом, эффективный и надежный метод генерации и изолировать цены за клик имеет большое значение для исследований сердца клеточной терапии.
Этот протокол фокусируется на эмбриональных цены за клик, выявленных в ходе раннего эмбриогенеза и как их поколение из ЭСК. Различные ЦЧП были выделены из эмбриональных и взрослых сердец, даже из костного мозга 2. Во время развития эмбриона, кости morphogeмагнитные белки (BMPs), бескрылые типа члены семьи интеграции MMTV сайт (WNTs) и узловых сигналы вызывают приверженность Mesp1 + мультипотентной мезодермы 3. Mesp1 + клетки затем дифференцируются в эмбриональные цены за клик 4. Эти цены за клик, как правило, отмечается HCN4, NK2 гомеобокс 5 (Nkx2-5), Isl LIM гомеобокс 1 (Isl1), T-бокс 5 (Tbx5), и миоцитов фактором усилитель 2C (Mef2c), образуют поля первичного и вторичного сердце, и способствовать основных частей сердца во время кардиогенеза 5-10. Цены за клик Как Nkx2-5 + и Isl1 + / MEF2C + способны дифференцироваться в кардиомиоциты, гладкие мышечные клетки (ГМК) и эндотелиальные клетки 5-8. Таким образом, эти ЦЧП будет приводить к сердечной сосудистой, а также сердечных тканей и идеальным источником клеток для клеточной основе сердечной терапии. Следовательно, создавая цены за клик в пробирке был крупным научным внимание при сердечно-сосудистых исследований. С ЭСК имеют неограниченное расширение емкости ай представляют ICM клетки на стадии бластоцисты, дифференциация ЭСК в эмбриональные цены за клик по естественному эмбриогенеза считается логичным и эффективным подходом для получения цены за клик.
Одним из широко используемым подходом для получения цены за клик от ЭСК является агрегирование ЭСК в ЭТ 11. Для повышения эффективности дифференциации, определенные химические и факторы роста, основанные на знании развития сердца были использованы 12-14. Тем не менее, нет никаких категорических КПК маркеры, в частности, нет клеточной поверхности маркеры, которые широко принятые в этой области. Чтобы решить эту проблему, ЭСК разработаны, чтобы отметить цены за клик Isl1 + или MEF2C + и их производные флуоресцентных журналистами, используя Cre системы / LoxP. CRE рекомбиназы постучал в под контролем Isl1 / Mef2c промотор / энхансер. Модифицированный люминесцентные RFP белок или ген YFP обусловлен конститутивного промотора может быть активирован удаления Flox стоп-кодона с CRE рекомбиназой(Isl1: CRE; pCAG-Flox-СТОП-Flox-GFP или RFP / Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; Rosa26YFP) 5,6. После того, как ЭСК дифференцируются во вторые СРС сердце на местах, Isl1 / Mef2c промотор / энхансер приводом CRE активирует флуоресцентные журналистам и цены за клик может быть обогащен FACS-очистки. Вкратце, метод агрегирования EB используется для инициирования ESC дифференциации. Для повышения эффективности дифференцировки, дифференцированные клетки обрабатывают аскорбиновой кислоты (АК) и факторов роста, таких как Bmp4, активин А и Vegf 13,15. Этот протокол позволяет надежный и эффективный дифференциации CPC, используя и мышь и ЭСК человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Leonid Gnatovskiy for his carefully and critical reading of the paper. This work was supported in part by grants from the National Institutes of Health (HL109054) and the Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) to WZ and from the Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine to BL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| FBS | Thermo scentific | SH30070.03E |
| Knockout SR | Life technology | 10828028 |
| Knockout DMEM | Life technology | 10829018 |
| DMEM | Life technology | 11965118 |
| NEAA | Life technology | 11140050 |
| GlutaMAX | Life technology | 35050061 |
| N2 | Life technology | 17502048 |
| B27 | Life technology | 12587010 |
| Ham’s F12 | Life technology | 11765062 |
| IMDM | Life technology | 12440061 |
| Pen/Strep | Life technology | 15140122 |
| Pyruvate | Life technology | 11360070 |
| Dispase | Life technology | 17105041 |
| Stempro-34 | Life technology | 10639011 |
| DMEM/F12 | Life technology | 11330032 |
| BSA | Life technology | 15260037 |
| Trypsin | Life technology | 25200056 |
| Ascobic Acid | Sigma | A5960 |
| 1-Thioglycerol | Sigma | M1753 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
| VEGF | R&D | 293-VE |
| Bmp4 | R&D | 314-BP |
| ActivinA | R&D | 338-AC |
| bFgf | R&D | 233-FB |
| Fgf10 | R&D | 345-FG |
| mTeSR | Stemcell technologies | 5850 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
References
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
- Bondue, A., Blanpain, C. Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment. Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).
- Bondue, A., et al. Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification. Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development. The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).
- Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).
- Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).
- Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Wada, R., et al. Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).
- Wamstad, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151 (1), 206-220 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Gaj, T., Gersbach, C. S., Barbas, T. A. L. E. N. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
- Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).
- Bizy, A., et al. Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes. Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).
